블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

요약

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

초록

광합성 전자 전송 체인 (등) NADPH와 ATP의 형태로 화학 에너지로 태양 에너지를 변환합니다. 4 개의 큰 단백질 복합물 NADP⁺ photosystems 통해 두, 물에서 전자를 드라이브 하 고 생성된 된 양성자 기온 변화도 사용 하 여 ATP의 생산을 위한 thylakoid 막 수확 태양 에너지에 포함. Photosystem PSII, PSI, 시 토 크롬 b₆f (Cyt b₆f) 및 ATPase는 뚜렷한 방향과 thylakoid 막에서 역학으로 모든 multiprotein 복합물. 온화한 세제의 기본 젤 전기 이동 별거 다음으로 막 무결성에서 단지 solubilizing 여 구성과 thylakoid 막에서 단백질 복합물의 상호 작용에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다는 단지입니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 기능 형태로 단백질 복합물의 분리에 사용 되는 분석 방법 이다. 자세한 구조 분석을 위해 단백질 복잡 한 정화에 대 한 메서드를 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 또한 단백질 복합물 간의 동적 상호 작용을 해 부를 도구를 제공 합니다. 메서드를 사용 하면 미토 콘 드리 아 호흡 단백질 복합물의 분석을 위해 개발 되었다 하지만 이후 되었습니다 최적화 있으며 thylakoid 단백질 복합물의 해 부에 대 한 개선. 여기, 우리가 정한 광합성 단백질 복합물 및 애기 thaliana에서 그들의 상호 작용의 분석에 대 한 상세한 최신 프로토콜을 제공합니다.

서문

큰 multisubunit 단백질 복합물 photosystem PSI과 PSII, Cyt b₆f와 ATPase 광합성 빛 반응에서 ATP와 NADPH의 생산 조정. 더 높은 식물의 엽록체에는 단지는 구조적으로 다른 유형의 막 구조, appressed grana 및 appressed 비 기질 thylakoids thylakoid 막에 있습니다. 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그들의 네이티브 및 생물학적 활성 형태로 큰 multisubunit 단백질 복합물의 분석에는 광범위 하 게 사용 되는 방법 이다. 방법¹, 미토 콘 드 리아 멤브레인의 단백질 복합물 해 부에 대 한 설립 되었다 하지만 나중 thylakoid 막 네트워크³에서 단백질 복합물의 분리에 대 한 사용자 지정 된. 방법은 (i) 구조 분석, (ii) 단백질 복합물 사이 기본 상호 작용을 결정 하 고 (iii) 단백질 복합물의 전체 조직 분석에 대 한 개별 thylakoid 단백질 복합물의 정화에 적합 시 환경 큐를 변경 합니다.

이전에 분리, 단백질 복합물 신중 하 게 선택한 비 세제는 일반적으로 온화 하 고 단백질 복합물의 기본 구조를 보존 막 으로부터 격리 됩니다. 세제 소수 포함 하 고 친수성 사이트 및 특정 농도, 위의 형태 안정 micelles 라는 중요 한 micellar 농도 (CMC). CMC 결과 지질-지질 상호 작용의 고 단백질 복합물의 가용 화에 세제 농도 증가. 세제의 선택에는 세제의 가용 화 능력 및 관심사의 복잡 한 단백질의 안정성에 따라 달라 집니다. 일상적으로 사용된 세제 α/β-라우릴-maltoside 및 digitonin을 포함합니다. 그들의 네이티브 국가에서 단백질 복합물의 가용 화에 따라 불용 성 물질은 원심 분리에 의해 제거 됩니다. 더 높은 식물에서 thylakoid 막 구조에 매우 heterogenic 이며 일부 세제 (예: digitonin)는 선택적으로 막³의 특정 부분만 solubilize. 따라서, 단백질 복잡 한 조직 또는 단백질 복합물 사이 상호 작용의 특성, 그것은 항상 엽록소 콘텐츠, 엽록소 a/b를 확인 하 여 선택한 세제의 가용 화 능력을 결정 하는 중요 한 상쾌한 solubilized 분수의 수익률 및 대표 thylakoid (하위) 도메인을 각각 평가 비율. 엽록소 a/b 비율 성장 빛 풍토 식물의 그대로 thylakoids에는 일반적으로 약 3, 반면는 chl는 thylakoid 분수의 b 값 grana에 농축 또는 기질 thylakoids (~ 2.5) 미만으로 떨어지면 (~ 4.5) 총의 값 보다 thylakoids, 각각.

단백질 복합물에 부정적인 요금을 제공 하려면 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 염료 solubilized 샘플에 추가 됩니다. 충전 시프트 인해 단백질 복합물 양극 쪽으로 이동 하 고 그들의 분자 질량과 모양에 따라 아크릴 (AA) 그라데이션에 구분 됩니다. 효과적이 고 고해상도 분리 선형 아크릴 아 미드 농도 기온 변화도 사용 하 여 이루어집니다. 전기 이동 법, 동안 그들의 크기에 종속 기 공 크기 제한에 도달할 때까지 단백질 복합물 양극 쪽으로 마이그레이션합니다. Polyacrylamide 젤의 기 공 크기 (i) 총 아크릴에 따라 달라 집니다 /두번째-아크릴 아 미드 농도 (T) 및 (ii) cross-linker 두번째-아크릴 모노 머 농도에 (C) 총 단위체⁴를 기준으로. BN 페이지와 분리 후 단백질 복합물 수 수 더 세분화 그들의 개별 단백질 소 단위 2 차원 (2D)-SDS-페이지. 여기, 우리는 BN-페이지/2D-SDS-페이지 thylakoid 막 단백질 복합물의 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

1. 준비 비 엔 젤^1,2,3

1. 0.75 m m의 스페이서를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 cm x 10 cm 플레이트 (직사각형 유리 및 노치 알 루미나 판)와 젤 캐스터를 설정 합니다.
2. 그라데이션 믹서를 저 어 접시에 놓고는 배관에 의해 연동 펌프와 연결 합니다. 주사기 바늘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 하 고 유리 및 알루미늄 격판덮개 사이 바늘을 배치. "무거운" (H)에 장소 자력-챔버.
3. 대비 3.5% (v/v) 및 12.5% (v/v) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 아크릴 (AA) 솔루션 분리 젤 그라데이션 (참조 표 1에). 불의 중 합을 방지 하기 위해 솔루션을 준비 하는 동안 얼음에 원심 분리기 튜브를 유지.
   주의: 아크릴은 신경 및 발암 성, 마모 보호 옷과 장갑.
4. 그라데이션 믹서에 대 한 해결책을 pipetting 전에 5 %APS TEMED 오른쪽을 추가 합니다. 피펫으로 H-챔버에 12.5% 솔루션.
   1. L-챔버를 입력 하는 솔루션을 수 있도록 두 개의 챔버를 연결 하는 밸브를 열어 "빛" (L)과 H-챔버를 연결 하는 채널에서 기포를 제거 합니다. 밸브 및 피펫으로 솔루션의 H-챔버를 다시 닫습니다.
   2. 마지막으로, 피펫으로 L-약 실에 3.5% 솔루션.
5. 스위치는 자력에 (는 저 속도가 중요 하지만 무 겁 고 가벼운 솔루션의 적절 한 혼합 되도록 해야), 밸브를 열고 연동 펌프에 전환. 유리 및 알루미늄 판 사이에 젤 솔루션을 허용, flowrate는 대략 0.5 mL/min. 바늘 해야 액체 위에 모든 시간, 그것은 테이프와 함께 유리 접시의 위쪽 부분을 연결할 수 있습니다.
6. H와 L 챔버는 비운 초순 그들을 채울 고 부드럽게 오버레이 젤 표면 물 허용. 젤 중 합 실시간에 약 1-2 시간 소요
7. 3% 아크릴 솔루션 준비 (참조 표 1제조 법)는 스태킹에 대 한 생산 분리 젤 위에 겹쳐 쌓이는 젤에 실시간 피펫으로 젤 (겹쳐 쌓이는 젤을 주조 하기 전에 제거 젤 표면 overlaying 물) 배치 샘플 젤 빗 사이는 유리와 알루미늄 플레이트 피하 공기 방울.
   1. 30-60 분 실시간 제거 초순에서 부드럽게 빗에 유해 하실 수 있습니다. 젤 + 4 ˚C에 저장 합니다.
      일시 중지 포인트입니다. 젤은 몇 일 동안 + 4 ˚C에 저장할 수 있습니다. 젤은 우물과 젤 표면의 건조를 피하기 위해 습 한 조건에서 보관 한다.

2. Thylakoid 가용 화^1,2,3

참고: 모든 단계는 매우 희미 한 빛 속에서 수행 되어야 합니다. 샘플 및 버퍼 얼음에 계속.

1. 얼음 처럼 차가운 25BTH20G 버퍼 1 mg/mL의 최종 엽록소 농도를 가진 고립 된 thylakoids를 희석. 엽록소의 µ g 2D BN SDS 페이지 분석 약 4-8에 대 한 샘플은 적합 /.
   참고: thylakoids는 실험에 사용 되는 (thylakoid 절연, 참조³프로토콜)에 대 한 신선한 잎에서 격리 되어야 합니다.
2. 세제 버퍼, 즉, 2% β-DM (w/v) 또는 2%의 동일한 볼륨 추가 digitonin (w/v). 부드럽게 피펫으로 팁 thylakoid 샘플에 세제를 혼합 하 고 기포를 만들기 방지. 세제의 최종 농도 1%와 thylakoids 0.5 mg Chl/mL 이다.
   1. 얼음 (β-디 엠) 또는 로커/통 (digitonin)에 연속 부드러운 혼합과 RT에서 10 분 2 분 thylakoids solubilize
      참고: thylakoid 단백질 복합물의 가용 화에 대 한 Digitonin 및 β-DM 사용 일반적으로 됩니다. 다른 비 이온 세제 사용 하는 경우 세제 농도 및 가용 화 시간 해야 합니다 먼저 최적화. 일반적으로 세제 농도 범위에서 0.5%-5% (v/v).
      주의: Digitonin은 독성 보호 옷을 입고, 장갑
3. Insolubilized 자료 + 4 ˚C에서 20 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리 하 여 제거 합니다.
4. 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플을 CBB 버퍼의 1/10 (v/v)를 추가 합니다.
   참고: thylakoid 막 단백질 복합물의 전체적인 구성, 시험 수확량 및 solubilized 분수의 대표 thylakoid 도메인 확인 것이 좋습니다. Solubilized 자료의 수익률을 확인 하려면 (CBB 추가) 하기 전에 새로운 튜브는 상쾌한의 5 µ L을 하 고 측정 Chl 내용과 Chl a / b 비율⁵.

3. 비-페이지^1,2,3

1. 수직 전기 시스템 (예: Hoefer SE 250) 젤을 설정 합니다. 위의 버퍼 챔버 블루 음극 버퍼 채우기 ( 표 1참조) 양극 버퍼는 더 낮은 버퍼 약 실에 붓는 다.
2. 우물에 thylakoid 샘플 (엽록소의예를 들어, 5 µ g)를 로드 합니다.
3. 전기 이동 법을 시작 하 고 서서히 전압을 증가: 75 V 30 분, 30 분 동안 100 V, 30 분 125 V, 150 V 1 h와 V는 단지까지 175 완전히 분리 되었다. 에 젤 + 4˚C, 차가운 룸을 사용 하거나 냉각 시스템 젤 온도 조정 실행 합니다.
   참고: 샘플 전면 젤의 1/3 정도 마이그레이션한 때 블루 음극 버퍼 분명 음극 버퍼에 변경 합니다.
4. 전기 이동 실행 후 이미지 보관에 대 한 photoscanner와 젤 스캔.

4입니다. 2D SDS 페이지

1. 수직 전기 시스템 (젤 크기 16 cm x 20 cm)를 조립 한다. 1mm 스페이서를 사용 합니다.
2. 2D-빗 (스트립 및 분자량 표식에 대 한 하나의 표준 잘 큰 단일) 표준 SDS 젤 (12% 아크릴, 6 M 요소, 표 2제조 법 참조)를 준비 합니다.
3. BN 젤에서 차선을 잘라내어 (5 mL) 튜브에. Laemmli 버퍼 (5% β-mercaptoethanol 포함)의 2 개 mL를 추가 하 고 실시간에 부드러운 진동으로 45 분 동안 스트립을 품 어
4. 예를 들어, 기포 방지 젤 위에 스페이서의 도움으로 레인을 놓습니다.
5. 피펫으로 5 종이 필터와 장소를 잘 표준 종이의 좁은 조각에 분자량 마커의 µ L.
6. BN 젤 스트립 및 마커 종이 인감, (실행 버퍼)에 0.5 %agarose 젤 스트립 위에 부 어 하 고 공고히 하 허용.
7. 전기 이동 법 프로토콜 표준에 따라 수행 합니다. 전기 이동 실행, 예를 들어, Sypro 루비 얼룩과 단백질 또는⁶에 따라 얼룩은 시각화.

결과

그림 1 에 대표적인 2D BN/SDS 페이지 시스템 digitonin 및 β-DM solubilized thylakoid 단백질 복합물의 분리 및 그들의 상세한 단백질 소 단위 구성 방법을 보여 줍니다. PSII-LHCII-PSI megacomplex, 2 개의 큰 PSII LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI 단량체 (m), PSII m/Cyt solubilized digitonin thylakoids ( 그림 1A상단 위에 가로 젤)의 단백질 복잡 한 패?...

토론

광합성 에너지 변환 기계 thylakoid 막에 포함 된 큰 multisubunit 단백질 복합물으로 구성 된다. 이 프로토콜 애기 thaliana 2D SDS 페이지와 결합 된 BN 페이지에서 식물 thylakoid 단백질 복합물의 분석을 위한 기본적인 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 또한 담배와 시금치 thylakoids에서 thylakoid 단백질 복합물의 분석에 적합 하지만 작은 조정 해야 할 수도 있습니다.

막 단백질 복합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813