Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Протокол для освещения растений тилакоидных белков сложной организацией и композиция с голубой родной полиакриламида гель электрофореза (БН-страница) и описал 2D-SDS-PAGE. Протокол оптимизирован для Arabidopsis thaliana, , но может быть использован для других видов растений с незначительными изменениями.

Аннотация

Фотосинтетической электрон передачи цепи (и т.д.) преобразует солнечную энергию в химическую энергию в виде АТФ и НАДФН. Четыре крупных белковых комплексов встроенный в тилакоидной мембраны урожай солнечной энергии поехать NADP⁺ через двух фотосистем электронов от воды, и использовать созданный протонного градиента для производства АТФ. PSII фотосистемы, PSI, цитохромы b₆f (Cyt b₆f) и АТФазы являются все multiprotein комплексы с различные ориентации и динамика в тилакоидной мембраны. Можно получить ценную информацию о составе и взаимодействия белковых комплексов в тилакоидной мембране, растворяющие комплексы от целостности мембраны, мягкими моющими средствами, следуют электрофоретического разделения родной гель комплексы. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является аналитический метод, используемый для разделения белковых комплексов в их родной и функциональной форме. Этот метод может использоваться для сложных очищение протеина для более детального анализа структурных, но он также предоставляет инструмент для того чтобы рассечь динамического взаимодействия между белковых комплексов. Метод был разработан для анализа митохондриальной дыхательных белковых комплексов, но с тех пор были оптимизированы и улучшены для рассечения тилакоидов белковых комплексов. Здесь мы предоставляем подробную обновленную протокол для анализа лабильной фотосинтетической белковых комплексов и их взаимодействия в проростках Arabidopsis thaliana.

Введение

Большие multisubunit белка комплексы фотосистем PSI и PSII, Cyt b₆f и АТФазы координировать производства АТФ и НАДФН в фотосинтетических реакциях свет. В высших растений хлоропластов комплексы расположены в тилакоидной мембране, который является структурно гетерогенных мембраны структурой, включающей прижаты Грана и тилакоидов стромы не прижаты. Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является широко используемым методом при анализе больших multisubunit белковых комплексов в их родной и биологически активной форме. Этот метод был создан для рассечения митохондриальной мембраны белковых комплексов¹, но позже был настроен для разделения белковых комплексов в тилакоидной мембраны сети³. Этот метод подходит (i) для очистки отдельных тилакоидов белковых комплексов для структурного анализа, (ii) для определения собственных взаимодействий между белковых комплексов и (iii) для анализа общей организации белковых комплексов После изменения окружающей среды подсказки.

До разделения белковых комплексов изолированы от мембраны с тщательно подобранными неионогенных моющих средств, которые, как правило, мягкая и сохранения родной структуры белковых комплексов. Моющие средства содержат гидрофобных и гидрофильных сайты и стабильные формы мицеллы выше определенной концентрации, называется критической концентрации мицеллярный (CMC). Повышение концентрации моющего средства над результатами CMC, в нарушение взаимодействия липидов липидов и солюбилизация белковых комплексов. Выбор моющего средства зависит от стабильности белкового комплекса интереса и солюбилизация количество моющего средства. Регулярно используются моющие средства включают α/β-додецил maltoside и digitonin. После солюбилизация белковых комплексов в их родном государстве нерастворимый материал удаляется путем центрифугирования. В высших растений мембрана тилакоида весьма неоднороден в структуре и некоторые моющие средства (например, digitonin) избирательно солюбилизировать последнего только конкретную часть мембраны³. Таким образом чтобы характеризовать организации сложных белков или взаимодействия между белковых комплексов, важно всегда определить мощность солюбилизация выбранного моющего средства, определяя содержание хлорофилла и хлорофилла a/b отношение супернатант для оценки урожайности и представлены тилакоид (суб) домена, соответственно, растворимых дроби. Хлорофилл a/b в нетронутыми тилакоидов роста свет акклиматизации растений составляет обычно около 3, тогда как chl / значение b тилакоидных фракций обогащенный либо в Грано или тилакоидов стромы падает ниже (~ 2.5) или превышает значение общего (~ 4.5) Тилакоиды, соответственно.

Чтобы обеспечить отрицательный заряд для белковых комплексов, Кумасси блестящий синий краситель (НБР) добавляется растворимых образца. Из-за смены заряда белковых комплексов мигрируют к аноду и отделены с уклоном акриламида (АА), по словам их молекулярной массе и форме. Эффективное и высоким разрешением разделение достигается с помощью градиента концентрации линейных акриламида. Во время электрофореза белковых комплексов мигрируют к аноду до тех пор, пока они достигают их размер зависит от размера пор предел. Размер поры геля полиакриламида зависит от (i Общая акриламида /бис- акриламид концентрация (T) и (ii) на крест-компоновщик бис- акриламид мономера концентрации (C) по отношению к общей мономеров⁴. После разделения с БН-страницы белковых комплексов можно далее подразделить их индивидуальных белковых субъединиц, второй измерение (2D) - SDS - PAGE. Здесь мы описываем подробный протокол для анализа тилакоидной мембраны белковых комплексов по БН-страница/2D-SDS-PAGE.

протокол

1. Подготовка млрд лари¹^,²^,³

Настройка гель заклинателя плитами 8 x 10 см (прямоугольные стекла и пластина зубчатая глинозема) согласно инструкциям производителя, используя распорки 0,75 мм.
Место градиент миксера на тарелку, перемешать и подключить его с перистальтических насосов, труб. Прикрепите иглой шприца в другой конец трубки и поместите иглу между стекла и алюминиевых пластины. Магнитная мешалка место для «тяжелых» (H)-камеры.
Подготовьте 3,5% (v/v) и 12,5% (v/v) акриламида (АА) решения в 15 мл конические пробирок для разделения гель градиента (см. рецепты в таблице 1). Во избежание преждевременной полимеризации, держите пробирок на льду при подготовке решений.
Предупреждение: Акриламид является нейротоксического и канцерогенными, носить защитную одежду и перчатки.
Добавьте 5% APS и TEMED прямо перед закупорить решения градиент миксера. Накапайте 12,5% раствора H-камере.
1. Удаления пузырьков воздуха из канал, соединяющий «свет» (L) и H-палата, открыв клапан, соединяющий две камеры, позволяя решение вступить в L-камеру. Закройте клапан и пипетки следы решения обратно к H-камере.
2. Наконец накапайте 3,5% раствор L-камере.
Переключение на магнитной мешалкой (скорость перемешать не является критической, но она должна обеспечивать надлежащее смешивание тяжелых и легких решений), откройте клапаны и включите перистальтического насоса. Позволяют решения гелем между стекла и алюминиевых пластины, расхода должна быть примерно 0,5 мл/мин. Игла должна быть выше жидкости все время, она может быть присоединена к верхней части стеклянной пластины с ленты.
Когда камеры H - и L-опустели, заполнить их с ультрачистая вода и позволить воде нежно наложение на поверхность геля. Полимеризации геля занимает около 1-2 часа на RT.
Приготовляют раствор акриламида 3% (см. рецепт в таблице 1) для укладки гель на RT. Накапайте штабелируя гель на вершине полимеризованной разделение геля (перед заливкой штабелируя гель, удалить воду, наложение на поверхность геля) и поместите образец гель гребень между стекла и алюминиевых пластины избегая пузырьки воздуха.
1. Позвольте полимеризоваться 30-60 мин на RT. Remove гребень мягко под ультрачистая вода. Храните гель на + 4 градусов.
  Паузы точки. Гель может храниться при + 4 ° c на несколько дней. Геля должны храниться в влажных условиях во избежание высыхания поверхности геля и колодцы.

2. тилакоид солюбилизация¹^,²^,³

Примечание: Все шаги должны выполняться под очень тусклый свет. Храните образцы и буферы на льду.

Разбавьте изолированных тилакоидов с ледяной 25BTH20G буфер для окончательного хлорофилл концентрации 1 мг/мл. Для 2D-BN-SDS-PAGE анализ примерно 4-8 мкг хлорофилла / образец подходит.
Примечание: Тилакоиды, используемых в экспериментах должны быть изолированы от свежих листьев (для протокола тилакоидов изоляции, см³)
Добавить равный объем моющего средства буфера, т.е. 2% β-DM (w/v) или 2% digitonin (w/v). Осторожно перемешать моющего средства для тилакоидов образца с кончиком пипетки и избежать воздушных пузырей. Конечная концентрация моющего средства — 1% и что тилакоидов 0,5 мг Chl/мл.
1. Солюбилизировать последнего тилакоидов 2 мин на льду (β-DM) или 10 минут на RT с непрерывной нежный смешивания на Рокер/шейкер (digitonin).
  Примечание: Digitonin и β-DM обычно используются для солюбилизация белковых комплексов в тилакоидной. Если используются другие неионных моющих средств, концентрации моющего средства и время солюбилизация должны быть сначала оптимизированы. Обычно диапазон концентрации моющего средства от 0,5% - 5% (v/v).
  Предупреждение: Digitonin это токсичные, носите защитную одежду и перчатки
Удалите insolubilized материал центрифугированием на 18,000 x g для 20 минут, на + 4 градусов.
Супернатант передать новой 1,5 мл трубки и добавить 1/10 (v/v) CBB буфера выборки.
Примечание: Когда рассматривается общий состав тилакоидной мембраны белковых комплексов, определения урожайности и представлены тилакоидов домен растворимых фракций рекомендуется. Чтобы определить доходность растворимых материалов, принять 5 мкл супернатант новой трубки (перед добавлением CBB) и измерить содержание хлорофилла и Chl / b коэффициент⁵.

3.²^,¹^,BN-страница³

Настройка гель для системы вертикального электрофореза (например, 250 SE Хофер). Заполните палата верхней буфера с голубой катод буфера (см. таблицу 1) и залить Анодный буфер в нижнюю палату буфера.
Загрузить тилакоидов выборки (например, 5 мкг хлорофилла) в скважинах.
Электрофорез и постепенно увеличивайте напряжение: напряжение 75 В течение 30 мин, 100 V 30 мин, 125 V 30 мин, V 1 h 150 и 175 V до комплексов были разделены полностью. Запустите геля на + 4˚C, либо с помощью холодной комнате или корректировке температуры гель с системой охлаждения.
Примечание: Измените буфере синий катод ясно катод буфер когда образец фронт мигрировало около одной трети от геля.
После электрофореза запуска сканирования гель с photoscanner для архивирования изображений.

4. 2D-SDS-PAGE

Соберите систему вертикального электрофореза (гель размер 16 x 20 см). Используйте прокладки 1 мм.
Подготовьте стандартные геля SDS (12% акриламида, 6 M мочевины, рецепт см. в таблице 2) с 2D-гребень (одной большой хорошо для газа и один стандартный хорошо для маркер молекулярного веса).
Вырежьте полосу от БН гель и поместите его в трубу (5 мл). Добавить 2 мл буфер Лэмли (содержащие 5% β-меркаптоэтанол) и инкубировать газа для 45 мин с нежным встряхивания на RT.
Поместите полосу, с помощью например, распорки, поверх геля, избегая пузырьков воздуха.
Накапайте 5 мкл маркер молекулярного веса на узкий кусок фильтровальной бумаги и место бумаги к стандарту хорошо.
Для герметизации полосы BN-гель и маркер бумаги, залить сверху полосе гель агарозы 0,5% (в снаряженном буфера) и позволяют укрепить.
Провести электрофорез по стандартным протоколам. После электрофореза, визуализируйте белки с например, пятно Sypro Ruby или серебряный пятнать по⁶.

Результаты

Представительной системы 2D-BN/SDS-PAGE в Рисунок 1 демонстрирует разделение digitonin и белковых комплексов в тилакоидной β-DM-солюбилизирован и их состав Субблок подробные белка. Сложный узор Белки тилакоидов digitonin солюбилизирован (горизонтальные лари на верхн...

Обсуждение

Механизм преобразования фотосинтетической энергии состоит из крупных multisubunit белковых комплексов, которые внедряются в тилакоидной мембраны. Этот протокол описывает основной метод для анализа растений тилакоидов белковых комплексов от Arabidopsis thaliana с БН-страницы в сочетании с 2D-SDS-...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было финансовой поддержке Академии Финляндии (номера проектов 307335 и 303757) и солнечной энергии биомассы (SE2B) Марии Склодовской-Кюри Грант соглашение (675006). Протокол основан на ссылка³.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813