ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

要約

プロトコル植物の解明のためチラコイドのタンパク質の複雑な組織と組成ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルとゲルの電気泳動 (BN-PAGE) と 2 D SDS ページの説明。プロトコルは、シロイヌナズナ、最適です、マイナーな修正と他の植物種に使用できます。

要約

光合成電子伝達鎖 (など) は、NADPH および ATP の形で化学エネルギーに太陽エネルギーを変換します。4 つの大きい蛋白質の複合体は、チラコイド膜の収穫 NADP⁺ 経由で2 ダメージを与えるに水から電子をドライブし、ATP の生産のために作成したプロトンの勾配を使用するための太陽エネルギーに埋め込まれます。光化学系 II 光化学系 PSI、チトクローム b₆f (チトクローム b₆f) および atp アーゼは、異なる方向とチラコイド膜ダイナミクスと多蛋白質複合体すべてです。ネイティブのゲルの電気泳動分離に続く穏やかな洗剤によって、複合体膜の完全性を可で組成、チラコイド膜蛋白質の複合体の相互作用に関する貴重な情報を得ることが、複合体。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブと機能的な形で蛋白質の複合体の分離に使用される手法です。詳細な構造解析のための蛋白質の複雑な浄化の方法を使用できますが、タンパク質複合体の動的相互作用を分析するためのツールも用意されています。メソッド、ミトコンドリア呼吸系膜タンパク質の解析用に開発されたが、以来最適化、チラコイドのタンパク質複合体の解離のために改善します。ここでは、不安定な光合成タンパク質複合体とシロイヌナズナにおけるそれらの相互作用の分析の詳しい最新のプロトコルを提供します。

概要

大規模な multisubunit 蛋白質複合体の光化学系 PSI と PSII、Cyt b₆f と ATPase 光合成の明反応で NADPH および ATP の生産を調整します。高等植物葉緑体密着グラナを有し、非密着の実質チラコイド構造的に異種の膜構造は、チラコイド膜の複合体があります。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブおよび生物学的にアクティブな形で大規模な multisubunit 蛋白質複合体の解析に広く使用された方法です。メソッドは、ミトコンドリア膜タンパク質複合体¹の解剖のために設立されましたが、チラコイド膜ネットワーク³からの蛋白質の複合体の分離の後でカスタマイズされています。(I) の構造解析、タンパク質複合体のネイティブ相互作用を決定するためには (ii) と (iii) 蛋白質複合体の全体的な組織の分析のための個々 のチラコイドのタンパク質複合体の精製方法が適してください。環境のキューを変更します。

分離前に蛋白質の複合体は一般に軽度し、蛋白質の複合体のネイティブ構造を維持する厳選された非イオン性洗剤膜から分離されます。洗剤を含んで疎水性と親水性のサイト特定濃度は, 上記フォーム安定するミセルと呼ばれる臨界ミセル濃度 (CMC)。脂質脂質の相互作用の中断と蛋白質の複合体の可溶化 CMC 結果上記洗剤の濃度を増加させます。洗剤の選択には、興味の複雑な蛋白質の安定性と洗剤の可溶化能力によって異なります。日常的に使用されている洗剤には、α/β-ドデシル-maltoside とジギトニンが含まれます。次の天然状態の膜タンパク質の可溶化、不溶性物質が遠心分離によって削除されます。高等植物におけるチラコイド膜が構造で高いというヘテロなといくつかの洗剤 (例えばジギトニン) が選択的に膜³の特定の一部分だけを可溶化します。したがって、それは常に葉緑素含量とクロロフィル a/b を決定することにより選択した洗剤の可溶化能力を決定する重要な蛋白質の複雑な組織または蛋白質の複合体間の相互作用を特徴付ける、可溶化画分の収量および表されたチラコイド (サブ) ドメインをそれぞれ評価する上清の比率。そのままチラコイド成長光順化植物のクロロフィル a/b 比は、通常約 3 chl、チラコイド画分の b 値を豊かにグラナのいずれか/または実質チラコイドを下回る (2.5 ~) (~ 4.5) の合計の値を超えるかチラコイド、それぞれ。

タンパク質複合体に負の電荷を提供するには、Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) 染料は可溶化されたサンプルに追加されます。電荷移動による蛋白質の複合体は陽極の方に移行、その分子の質量と形状によるとアクリルアミド (AA) グラデーションに区切られます。効果的かつ高分解能の分離は、線形アクリルアミド濃度勾配を使用して実現されます。自分サイズに依存した細孔サイズ制限に達するまで、電気泳動中に蛋白質複合体を陽極に向かって移行します。ポリアクリルアミドのゲルの細孔径によって異なります (i) 総アクリルアミド/ビス- アクリルアミド濃度 (T) と (ii) 架橋剤bis- アクリルアミド モノマー濃度 (C) 合計モノマー⁴を基準にして。BN ページと分離後、タンパク質複合体はさらに 2 番目の次元 (2 D) - SDS のページでに個々 のタンパク質サブユニットに分割できます。ここでは、BN-ページ/2 D-SDS-PAGE によるチラコイド膜蛋白質複合体の分析のための詳しいプロトコルについて述べる。

プロトコル

1 BN を準備するゲルの^1,2,3

1. 8 cm × 10 cm プレート (矩形ガラスとアルミナの切欠きプレート) 0.75 mm スペーサーを使用して製造元の指示に従ってゲル キャスターを設定します。
2. 撹拌プレート上グラデーション ミキサーを置き、ペリスタルティック ポンプ チューブで接続します。注射針をチューブのもう一方の端に接続し、ガラスとアルミのプレート間針を配置します。「重い」(H) に場所マグネチックスターラーの商工会議所。
3. 分離ゲル グラデーションの 3.5% (v/v)、12.5% (v/v) 15 mL コニカル遠沈管にアクリルアミド (AA) ソリューションを準備 (表 1のレシピを参照してください)。早すぎる重合を防ぐためには、ソリューションを準備している間氷上遠沈管を保ちます。
   注意: アクリルアミドは神経毒性や発癌性、摩耗防護服と手袋です。
4. グラデーションのミキサーにソリューションをピペッティングする前に 5 %temed と AP の権利を追加します。H チャンバーに 12.5% 溶液をピペットで移しなさい。
   1. ソリューション L チャンバーへの入力を許可する 2 つの部屋をつなぐ弁を開くことによって「光」(L) と H 室を接続するチャネルから空気の泡を削除します。ソリューションのトレース バック H 室にバルブとピペットを閉じます。
   2. 最後に、ピペット L チャンバーに 3.5% ソリューション。
5. 磁性攪拌器のスイッチ (撹拌速度が、重要ではありませんが、それは重いと光ソリューションの適切な混合を確認してください)、バルブを開き、蠕動ポンプのスイッチします。ガラスとアルミのプレートの間をフローするゲル ソリューションを許可する、流量は約 0.5 mL/min をする必要があります。針は液体の上すべての時間をする必要があります、それはテープでガラス板の上部に付けることができます。
6. H と L チャンバーを空にして、超純水でそれらを埋める、水ゲルの表面を優しくオーバーレイするようにします。ゲルの重合は、室温約 1-2 時間を取る
7. 3% アクリルアミド溶液を準備 (表 1のレシピを参照してください) したピペットでゲル、スタッキングのための重合分離ゲルの上にスタッキングのゲル (スタッキングのゲルを鋳造する前に削除ゲルの表面を覆う水) サンプル ゲル櫛を配置し、間、ガラスとアルミ プレート回避気泡。
   1. 削除した純水の下でそっと櫛で 30-60 分を重合することができます。+4 ° C でゲルを格納します。
      一時停止ポイント。ゲルは +4 ° C で数日間保存できます。井戸とゲルの表面の乾燥を防ぐため湿潤ゲルすべき。

2 チラコイドの可溶化^1,2,3

注: すべての手順は非常に薄暗い光の下で行わなければなりません。サンプルおよび氷の上のバッファーを維持します。

1. 最終的なクロロフィル濃度 1 mg/mL の冷たい 25BTH20G バッファーを分離チラコイドを希釈します。クロロフィルの 2 D BN SDS-PAGE 分析約 4-8 μ g の/サンプルが適しています。
   注: 実験に用いたチラコイド (を参照してください³チラコイド分離のプロトコル) の新鮮な葉から分離する必要があります。
2. 洗浄バッファー、すなわち2% β-DM (w/v) または 2% の等量を追加ジギトニン (w/v)。ピペット先端部に優しくチラコイド サンプルに洗剤を混合し、空気の泡を避けます。洗剤の最終濃度が 1%、チラコイド 0.5 mg/mL のクロロフィルの。
   1. 氷 (β-DM) やロッカー/シェーカー (ジギトニン) の連続的な穏やかな混合常温 10 分 2 分チラコイドを可溶化します。
      注: ジギトニンと β DM 一般的にチラコイド膜タンパク質の可溶化に使用されます。その他の非イオン性洗剤を使用する場合洗剤の濃度と可溶化時間する必要があります最初最適化。通常洗剤濃度範囲 0.5%-5% (v/v) から。
      注意: ジギトニンは毒性・保護服・手袋です。
3. +4 ° C で 20 分間 18,000 × g で遠心分離によって不溶性物質を削除します。
4. 上清を新しい 1.5 mL チューブに転送し、CBB バッファーの 1/10 (v/v) をサンプルに追加します。
   注: チラコイド膜蛋白質複合体の全体の構成を調べたところ、収量および可溶性画分の表されたチラコイド ドメインを決定する勧めします。可溶化された材料の降伏を決定する (CBB を追加する) 前に、新しいチューブに上清の 5 μ L を取るし、クロロフィル コンテンツとクロロフィル測定、/b 比⁵。

3. BN-PAGE-^1,2,3

1. 垂直電気泳動システム (例えば、プラント SE 250) にゲルを設定します。青い陰極バッファーとチャンバー上部バッファー (表 1参照) と陽極バッファー バッファー下院を注ぐ。
2. 井戸にチラコイド サンプル (クロロフィルの例えば5 μ g) をロードします。
3. 電気泳動を開始し、徐々 に電圧を増加: 75 V で 30 分間、30 分間 100 V、30 分 125 V、150 V の 1 h および複合体まで 175 V が完全に分離されています。ゲル + 4˚C、寒い部屋を使用するか、冷却装置がゲルの温度を調整するを実行します。
   注: は、サンプル フロントがゲルの約 3 分の 1 を移行したとき明確な陰極バッファーに青い陰極バッファーを変更します。
4. 電気泳動の実行後画像のアーカイブ photoscanner とゲルをスキャンします。

4. 2 D SDS ページ

1. 垂直電気泳動システム (ゲルのサイズ 16 cm × 20 cm) を組み立てます。1 mm のスペーサーを使用します。
2. 2 D 櫛 (1 つのストリップの分子量マーカーの 1 つの標準的な井戸も大きな) と標準の SDS ゲル (12% アクリルアミド、6 M 尿素、表 2のレシピを参照してください) を準備します。
3. BN ゲルから車線を切断し、(5 mL) チューブでそれを置きます。2 mL の塩化物イオンとバッファー (5% β-メルカプトエタノールを含む) を追加し、室温穏やかな揺れで 45 分のためのストリップを孵化させなさい
4. 例えば空気の泡を回避するゲルの上に、スペーサーの助けを借りて、レーンを配置します。
5. ピペット 5 μ L フィルター紙と場所も標準に紙の狭い部分の分子量マーカーの。
6. BN-ゲルのストリップとマーカー紙をシールするには、ゲルのストリップの上に (実行バッファー) に 0.5% の agarose を注ぎ、固化することができます。
7. 標準的なプロトコルによると電気泳動を行います。後、電気泳動の実行など可視ルビー汚れが付いている蛋白質または⁶によると染色銀を視覚化します。

結果

図 1に代表的な 2 D/BN-PAGE SDS システムは、ジギトニンと β DM 可溶化チラコイド膜タンパク質の分離や詳細な蛋白質サブユニット組成を示します。可溶化ジギトニン チラコイド (図 1 aの上部に上水平ゲル) の蛋白質の複雑なパターンは、PSII LHCII PSI の megacomplex、2 つの大きな PSII LHCII の supercomplexes (sc)、PSI LHCII とらえ超複合体...

ディスカッション

光合成エネルギー変換機構は、大規模な multisubunit 蛋白質複合体は、チラコイド膜に埋め込まれているので構成されます。このプロトコルでは、BN-PAGE-2D SDS-PAGE と組み合わせるとシロイヌナズナから植物チラコイドのタンパク質複合体の分析のための基本的な方法について説明します。プロトコルはタバコとほうれん草のチラコイドからチラコイド膜タンパク質の解析にも最適ですが、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813