عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض

Summary

هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة الكشف عن الفيروسات Zika أو التحكم في الأهداف في عينات البول ومصل الدم البشري أو البعوض بالنسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح). هذا الأسلوب لا يتطلب عزل الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن يتم في غضون 30 دقيقة.

Abstract

الإصابة بفيروس زكى (زيكف) يمكن أن تكون أعراض عند البالغين، إلا أن العدوى خلال الحمل يمكن أن يؤدي إلى الإجهاض، والتشوهات الخلقية العصبية الحادة. والهدف من هذا البروتوكول بسرعة الكشف عن زيكف في عينات من الإنسان والبعوض. معيار الذهب الحالي للكشف عن زيكف هو النسخ العكسي الكمي PCR (قرة-PCR)؛ عكس النسخ بوساطة حلقة التضخيم متحاور (RT-مصباح) قد تسمح لاختبار أكثر كفاءة وتكلفة منخفضة دون الحاجة إلى معدات مكلفة. في هذه الدراسة، يتم استخدام RT-مصباح للكشف عن زيكف في عينات بيولوجية مختلفة داخل 30 دقيقة، دون الأول عزل الحمض النووي الريبي من العينة. ويتجلى هذا الأسلوب استخدام زيكف إصابة المريض البول والمصل، وإصابة عينات البعوض. الحمض النووي الريبي ريبوسومال 18S واكتين تستخدم كعناصر تحكم في نماذج الإنسان والبعوض، على التوالي.

Introduction

في عام 2015، Zika الفيروسات (زيكف) اكتسبت الاهتمام العالمي البارز كمرض معد للقلق لأنه يرتبط ارتباطاً العدوى خلال الحمل بالإجهاض، الاملاص، والعيوب الخلقية العصبية الحادة بما في ذلك صغر الرأس، فضلا عن سائر خلقي ¹من العيوب الخلقية. في حالات نادرة، ارتبطت زيكف بمتلازمة غيان-باريه. زيكف تنتقل أساسا عن طريق بعوض؛ ومع ذلك، فإنه أيضا يمكن أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي¹. نظراً لأن العدوى مع زيكف غير متناظرة في معظم الناس، أو يعرض بأعراض تشبه الإنفلونزا خفيفة تتداخل مع أعراض عدوى أخرى أربورفيروسيس¹، كان هناك حاجة لتحسين أساليب الكشف السريع وفعالة من حيث التكلفة من زيكف شاشة كل الناس، فضلا عن السكان المحليين من البعوض.

النسخ العكسي الكمي PCR (قرة-PCR) تحليل موثوق بها للكشف عن زيكف؛ ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تكلفة المعدات المتخصصة والموظفين المدربين وعزل الحمض النووي الريبي من العينة للفائدة. النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح) هو أسلوب تضخيم حمض النووي خطوة واحدة تستند إلى تقنية PCR فقط تتطلب درجة حرارة الحضانة واحد نتيجة لاستخدام بوليميراز الدنا لاسخدام مع حبلا خصائص التشرد. هذا تلتف الحاجة ثيرموسيكلير ويقلل من طول الفترة الزمنية اللازمة لإتمام المقايسة. وتشمل المزايا الإضافية RT-مصباح خصوصية عالية وحساسية، ومتانة في طائفة من مستويات الحموضة ودرجات الحرارة، ومقاومة ل مثبطات بكر العديد من². أنها منخفضة التكلفة نسبيا والكاشفات مستقرة عند درجة حرارة الغرفة. ونظرا لهذه الخصائص، يمكن نشر RT-مصباح في مختبر أو في الميدان. وقد وضعت على هذا النحو، مصباح ردود الفعل للكشف عن مجموعة من العوامل الممرضة وأنواع أخرى من العدوى^3،،من⁴⁵. وهدف البروتوكول RT-مصباح، المذكورة في هذه الورقة الكشف عن زيكف دون عزل الحمض النووي الريبي في البشرية عينات مصل الدم والبول، وكذلك كما هو الحال في بعوضة مصابة واحدة خلال 30 دقيقة عن طريق RT-مصباح. يمكن استخدام هذا الأسلوب لاستبدال قرت-بكر كما هو أداة تشخيصية الحساسة والسريعة التي تعمل بسرعة وفي بيئات خارج المختبر.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بالمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) الصحة بومونت. جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة.

تنبيه: ينبغي معالجة جميع المواد المعدية يحتمل أن تكون وفقا لمعايير السلامة البيولوجية المستوى 2 بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية. ينبغي القيام بأي من الإجراءات التي قد تنتج الهباء الجوي في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي القيام بعمل مع البعوض يعيش في مرفق مفصليات الأرجل احتواء المستوى 1-3 مناسبة. نظراً لرابطة زيكف الإصابة بتشوهات خلقية، النساء الحوامل، تحاول أن تصور، أو الشركاء في هذه المرأة ينبغي كثيرا التقليل من تعرضهم المختبر إلى زيكف. نقل العينات زيكف تصنف في الولايات المتحدة "فئة ب المواد البيولوجية" وفقا لإدارة اللوائح المتعلقة بالنقل الخطرة المواد (49 CFR Part 171-180) وشحن العينات ولذلك ينبغي أن تلتزم تلك المبادئ التوجيهية. يتطلب استيراد بيوسبيسيمينس "الولايات المتحدة من زيكف" مراكز لمكافحة الأمراض والوقاية منها تراخيص الاستيراد. استيراد أي المفصليات التي يمكن أن تكون بمثابة ناقل لنقل زيكف، وحتى لو كانت غير مصابة، يتطلب الحصول على تصريح "وزارة الزراعة في الولايات المتحدة" (وزارة الزراعة). تعتبر هذه المعلومات الحالية في وقت النشر. يمكن الاطلاع على أحدث التوصيات في https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

ملاحظة: ردود الفعل RT-مصباح هم عرضه لمعدلات أعلى من ردود الفعل الإيجابية الكاذبة، حيث ينبغي اتخاذ الاحتياطات في التخطيط التجريبية. يجب استخدام جميع الإعداد والتنفيذ لردود الفعل RT-مصباح الماصات المعينة ونصائح عامل التصفية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تنشأ تدفق عمل الوحشي. إذا كان ذلك ممكناً، يجب أن يتم التحليل والتصوير (القسم 5) في غرفة مغلقة منفصلة لمنع التلوث. ينبغي أن تظل فتح أنابيب الاختبار التي تحتوي على منتجات RT-مصباح إلى الحد أدنى.

1 التحضير التمهيدي RT-مصباح

1. إعادة تشكيل كل التمهيدي RT-مصباح المجففة بالتبريد في الماء الصف الجزيئية لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر (الجدول 1). باختصار دوامة الحل التمهيدي لضمان حل متجانسة وتدور بإيجاز إلى الأسفل الحل بأقصى سرعة ممكنة في جدول أعلى أجهزة الطرد مركزي لجمع جميع التمهيدي الحل.
2. إعداد 10 × RT-مصباح "التمهيدي مزيج" من الإشعال FIP، المقاضاة، F3، B3، والمجلة، ورطل استخدام وحدات التخزين الموجودة في الجدول 2. باختصار دوامة الحل التمهيدي لضمان حل متجانسة، وتدور بإيجاز إلى الأسفل الحل بأقصى سرعة ممكنة في جدول أعلى أجهزة الطرد مركزي لتجنب أي خسارة.
   ملاحظة: لا تحتوي على مصباح RT التمهيدي عبد اللطيف-مصرية أكتين (عايض) تمهيدي رطل (كبسولة تفجير حلقة ليست دائماً ضرورية لردود الفعل RT-مصباح). في هذه الحالة، استبدال وحدة التخزين التمهيدي رطل مع المياه الصف الجزيئية.
3. تخزين الإشعال في-20 درجة مئوية بين الاستخدامات وتجنب دورات مجانية من الدفء.

2. إعداد نموذج

1. لعينات البول البشري: استخدام أما البول الطازجة أو المجمدة البول أو البول في حافظة. للعينة الطازجة أو المجمدة: فورا تدور أسفل العينة بعد جمع لمدة 10 دقيقة في 700 x ز، واستخدام المادة طافية للتحليل أو تجميد في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. ذوبان الجليد العينات المجمدة على الجليد قبل الاستخدام.
2. لعينات مصل الدم البشري: استخدام أما عينات مصلية الطازجة أو المجمدة.
3. زيكف المصابة خطوط الخلايا: استخدام وسائل الإعلام مشروطة أو خلية ليساتيس.
   ملاحظة: الخلية الحرة مكيفة وسائل الإعلام من عبد اللطيف. albopictus الخلايا C6/36 8 أيام بعد العدوى يمكن استخدامها كعناصر إيجابية لردود فعل زيكف RT-مصباح.
4. للبعوض Ae-مصرية : استخدام أما جثث البعوض كاملة طازجة أو مجمدة. ذوبان الجليد البعوض مجمدة في الجليد. إعداد البعوض خام ليساتي عن طريق بعوضة فردية في 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتجانسه بسحق البعوض 10 مرات مع تلميح بيبيت P10 (الشكل 1). باختصار الطرد المركزي النفط الخام بيليه أي حطام. استخدام المادة طافية للمتلقين للمعلومات مصباح RT التحليل.
   ملاحظة: يمكن إنشاء عناصر إيجابية في إعداد مختبر بإصابة أنثى البعوض باستخدام microinjection الوعائي مع مكافئات الجينوم³ حوالي 10 من الفيروس في مجلد من 200 nL وحصاد البعوض 5 أيام ما بعد الإصابة.

3-إعداد مزيج ماجستير RT-مصباح

1. إعداد رد فعل مزيج رئيسي RT-مصباح على الجليد للتمهيدي كل تعيين لاستخدامها باستخدام دليل التخزين في الجدول 3.
   ملاحظة: الاستخدام من اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA Glycosylase (UDG) يساعد في منع المغلوطة.
2. ثم تدور دوامة بإيجاز لضمان أن جميع العينات جيدا مختلطة، أسفل بإيجاز لمنع فقدان وحدة التخزين.

4-RT-مصباح بالانزيم

1. بيبيت 23.0 ميليلتر مزيج الرئيسي RT-مصباح كل رد فعل في أنبوب بكر 200 ميليلتر. إضافة ميليلتر 2.0 من عينة البول (مصل الدم، أو المادة طافية ليستي البعوض النفط الخام كما هو موضح في الخطوة 2). وهذا سيجلب الحجم الإجمالي ميليلتر 25.0 كل رد فعل RT-مصباح. لمراقبة سلبية، استخدام المياه الصف الجزيئية. إدراج عنصر تحكم إيجابية.
   ملاحظة: يمكن استخدام أرصدة القياسية أو الفيروسات PCR من المادة طافية خطوط الخلايا المصابة كعنصر إيجابي.
   1. اختياري: تشمل فعل تحكم خصوصية المفصليات ذات الصلة مثل فيروس حمى الضنك (DENV). تحضير العينة كما هو موضح في الخطوة 2 وفقا لنوع العينة. إضافة ميليلتر 2.0 لمراقبة النوعية إلى 23.0 ميليلتر من مزيج RT-مصباح رئيسية في أنبوب بكر 200 ميليلتر.
2. الحرارة العينات من 61 درجة مئوية مدة 30 دقيقة باستخدام كتلة الحرارة أو حوض ماء، أو ثيرموسيكلير.
3. إلغاء الحرارة بوليميراز بالتدفئة إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

5-مصباح RT التحليل

ملاحظة: إجراء تحليل RT-مصباح في مساحة منفصلة، والمغلقة.

1. بعد الحضانة، الوصول إلى ردود فعل RT-مصباح بصريا بالنظر لوجود تغيير اللون.
   1. يضعف الحمض النووي نيون صبغ 01:10 في المخزن المؤقت تاي (40 مم تريس، 20 ملم حمض الخليك، يدتا 1 مم).
      تنبيه: أي وصمة عار الحمض النووي بربط الأحماض النووية وذلك هو مادة مسرطنة. ارتداء القفازات عند التعامل.
   2. إلى 12 ميليلتر من رد فعل RT-مصباح، إضافة 2 ميليلتر لتمييع صبغة الفلورسنت الحمض النووي.
      ملاحظة: ردود الفعل السلبية سوف تكون برتقالية اللون وردود الفعل الإيجابية ستكون الأصفر/أخضر اللون.
   3. اختياري: التقاط صور لردود الفعل RT-مصباح على خلفية بيضاء باستخدام كاميرا.
2. وضع العينات تحت الأشعة فوق البنفسجية نانومتر 302 الخفيفة لتأكيد وجود منتجات RT-مصباح بالأسفار. التقاط صورة للنتيجة باستخدام كاميرا.
   ملاحظة: سوف يكون ردود فعل إيجابية RT-مصباح إخراج فلورسنت.
   تنبيه: ارتداء درع غوغل أو الوجه واقية العين الأشعة فوق البنفسجية عند العمل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
3. اختياري: تأكيد وجود منتجات RT-مصباح قبل تنفيذ استشراد هلام على العينات.
   1. صب 2% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TAE 1 مع وصمة حمض النووي للتصور.
      تنبيه: أي وصمة عار الحمض النووي بربط الأحماض النووية وذلك هو مادة مسرطنة. ارتداء القفازات عند التعامل.
   2. إضافة 5 ميليلتر سلم الحمض النووي في الممر الأول لمقارنة الأوزان الجزيئية.
   3. لكل رد فعل RT-مصباح، مزيج ميليلتر 13 RT-مصباح رد فعل خليط مع 2 ميليلتر لتحميل صبغ الحمض النووي. تحميل الخليط 15 ميليلتر التي تحتوي على الحمض النووي تحميل صبغ.
   4. تشغيل الهلام في 90 الخامس لمدة 90 دقيقة أو حتى يتم فصل العصابات والصورة مع 302 ضوء الأشعة فوق البنفسجية في شمال البحر الأبيض المتوسط.
      ملاحظة: ردود فعل إيجابية RT-مصباح سيكون نمط لاديرينج. لا يجب أن يتضمن ردود الفعل السلبية RT-مصباح أي العصابات.

6-التصرف

1. التخلص من ردود الفعل RT-مصباح في حقائب مختومة مزدوجة. عدم اﻷوتوكﻻف كهذا قد أيروسوليزي للمنتجات RT-مصباح، مما أدى إلى ردود فعل إيجابية كاذبة في المستقبل.

النتائج

يمكن تحليل ردود فعل RT-مصباح باستخدام ثلاث طرق مختلفة. أولاً، مع إضافة صبغة الفلورسنت الحمض النووي، ستكون ردود الفعل الإيجابية الأصفر/أخضر اللون حيث ستظهر ردود الفعل السلبية برتقالية اللون للعين المجردة. ثانيا، يؤدي إضافة صبغة الفلورسنت الحمض النووي لرد فعل RT-مصباح إشار?...

Discussion

الإنزيم زيكف RT-مصباح المبينة في هذه الورقة يعمل استخدام عينات الإنسان والبعوض⁶. كان الحد الأقصى للكشف عن حوالي 1 الجينوم ما يعادل⁶، الذي ينبغي أن يكون كافياً نظراً للحمل الفيروسي نموذجية للمريض زيكف المصابين بأعراض 10³ إلى 10 مل بفو/^{6 7}....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A