반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

요약

이 프로토콜 Zika 바이러스 탐지 또는 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)에 의해 대상 인간의 소변 및 혈 청 샘플 또는 모기를 제어 하는 효율적이 고 저렴 한 비용 메서드를 제공 합니다. 이 메서드는 RNA 격리는 필요 하지 않습니다 하 고 30 분 이내 할 수 있습니다.

초록

그러나 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 성인 무 증상 일 수 있다,, 임신 중 감염 유산 및 심각한 신경 기형이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 신속 하 게 모두 인간과 모기 샘플에서 ZIKV를 검색 하는 것입니다. ZIKV 검출에 대 한 현재 금 표준 이다 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR); 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)은 보다 효율적이 고 저렴 한 비용 테스트 고가의 장비에 대 한 필요 없이 수 있습니다. 본이 연구에서는 실시간 램프 첫 샘플에서 RNA를 분리 하지 않고 ZIKV 검출 다양 한 생물 학적 샘플 30 분 이내에 사용 됩니다. 이 기술은 ZIKV를 사용 하 여 환자 소변 및 혈 청, 감염 및 감염 모기 샘플 시연입니다. 18S ribosomal ribonucleic 산과 말라 각각 인간과 모기 샘플에서 컨트롤로 사용 됩니다.

서문

2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV) 주목 저명한 글로벌 관심사의 전염 성 질환으로 임신 중에 감염 유산, 사 산, microcephaly, 뿐만 아니라 다른 선 천 성 신경 심각한 출생 결함에 연결 했다 때문에 출생 결함¹. 드문 경우에, ZIKV Guillain-바레 증후군과 연결 되었습니다. ZIKV는 주로 Aedes 모기;로 전송 그러나, 그것은 또한 성적 접촉¹통해 확산 하실 수 있습니다. ZIKV 감염 대부분의 사람에서 무 증상 또는 다른 arborviruses¹의 감염의 증상과 겹치는 가벼운 감기 같은 증상으로 선물 한다, 그의 신속 하 고 비용 효율적인 검색을 위한 향상 된 방법 필요가 했다 사람 뿐만 아니라 현지 모기 인구를 화면에 ZIKV.

양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR)은 ZIKV 감지;에 대 한 신뢰성 분석 결과 그러나,이 기술은 고가의 특수 장비, 숙련 된 직원, 그리고 관심의 샘플에서 RNA 격리 해야합니다. 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)는만 가닥으로 thermophilic DNA 중 합 효소의 사용으로 인 한 부 화 온도 필요로 하는 PCR 기술에 따라 1 단계 핵 산 증폭 방법 변위 속성입니다. 이 thermocycler 니드 circumvents 고 분석 결과 완료 하는 데 필요한 시간을 줄입니다. RT-램프의 추가 장점 높은 특이성, 감도, 견고성 pH 수준 및 온도, 저항 많은 PCR 억제제²의 범위에 포함 됩니다. 그것은 상대적으로 저렴 한 비용 및 시 약은 실 온에서 안정. 이러한 특성을 감안할 때, RT-램프 배포할 수 있습니다 실험실에서 또는 분야에서. 등, 램프 반응 병원 체와 감염^3,,45의 다른 종류의 범위를 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 이 문서에 설명 된 RT 램프 프로토콜의 목표는 인간의 혈 청 및 소변 샘플에도 RT 램프를 통해 30 분 이내 단일 감염 된 모기에서 RNA 격리 없이 ZIKV를 감지. 그것은 실험실 밖으로 신속 하 고 설정에서 작동 민감한, 신속한 진단 도구 qRT-PCR을 대체 하이 메서드를 사용할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 버몬트 건강의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다.

주의: 잠재적으로 전염 하는 모든 자료는 개인 보호 장비의 사용을 포함 하는 Biosafety 수준 2 기준에 따라 처리 되어야 합니다. 에 어로 졸을 생산 있습니다 어떤 절차 biosafety 내각에서 수행 되어야 합니다. 또한, 라이브 모기 사용 적절 한 절지동물 포함 수준 1-3 시설에서 수행 되어야 합니다. 선 천 성 이상에 ZIKV 감염의 협회를 감안할 때, 여성은 임신, 임신 하려고 또는이 여자의 파트너 크게 최소화 해야 ZIKV에 그들의 실험실 노출 합니다. ZIKV 샘플의 카테고리 B 생물학 물질에 따라 학과의 교통 위험 물질 규정으로 미국에서 분류 된다 (49 CFR 부 171-180)을 준수 해야 합니다 따라서 샘플 배송 지침입니다. 미국의 ZIKV biospecimens로 가져오기는 센터를 질병 통제 및 예방 (CDC) 가져오기 허용 필요 하다. ZIKV 전송 위한 벡터 그들이 감염 되는 경우에 필요는 미국 농 무부 (USDA)으로 역할을 수 있는 모든 절지동물의 수입을 허용 합니다. 이 정보는 현재 간행물의 때에. 최신 추천 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html에서 찾을 수 있습니다.

참고: RT 램프 반응 주의 실험을 계획 한다 그래서 거짓 긍정적인 반응의 경향이 있다. 모든 설정 및 실시간 램프 반응의 실행 사용 해야 지정 된 펫 필터 팁 합니다. 이상적으로, 측면 작업 흐름을 설립 합니다. 만약에 가능 하다 면, 분석 및 영상 (5) 오염을 방지 하기 위해 별도 밀폐 된 공간에서 수행 되어야 합니다. 테스트 튜브 RT 램프 제품을 포함 하 여 최소한으로 유지 되어야 한다.

1. 실시간-램프 뇌관 준비

1. 100 µ M (표 1)의 최종 농도에 분자 학년 물에 각 동결 건조 된 RT 램프 뇌관 reconstitute 짧게 소용돌이 동종 솔루션을 보장 하 고 짧게 스핀 모든 뇌관 솔루션을 수집 하는 탁상용 원심 분리기에서 최대 속도로 솔루션 다운 뇌관 솔루션.
2. 10 준비 RT 램프 뇌관 믹스 볼륨을 사용 하 여 표 2에 FIP, BIP, F3, b 3, LF, 및 파운드 뇌관의 x. 짧게 소용돌이 동종 솔루션을 보장 하 고 짧게 스핀 손실을 방지 하기 위해 테이블 상단 원심 분리기에서 최대 속도로 솔루션 다운 뇌관 솔루션.
   참고: Ae aegypti 걸 (AEDAE)에 대 한 설정 RT 램프 뇌관 파운드 뇌관을 포함 하지 않는 (루프 뇌관 필요 하지 않습니다 항상 실시간 램프 반응). 이 경우에, 분자 학년 물 파운드 뇌관 볼륨을 교체 합니다.
3. -20 ° C 사용 하는 사이 뇌관을 저장 하 고 무료-해 동 주기를 피하십시오.

2. 샘플 준비

1. 인간 소변 샘플: 방부 제에 신선한 소변, 냉동된 소변, 또는 소변을 사용 합니다. 신선 또는 냉동 샘플: 즉시 샘플 다운 700 x g, 10 분에 대 한 수집 후 고는 상쾌한 분석에 대 한 사용 하 여 또는 나중에 사용-80 ° C에서 동결. 사용 하기 전에 얼음에 냉동된 샘플 녹여
2. 인간 혈 청 샘플: 신선 또는 냉동 혈 청 샘플 중 하나를 사용 합니다.
3. ZIKV에 대 한 감염 세포: 조절된 미디어 또는 세포 lysates 사용.
   참고: 미디어 Ae에서 조절 세포-무료. albopictus C6/36 셀 8 일 감염 된 후 ZIKV RT-램프 반응에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
4. Ae aegypti 모기: 전체 신선 또는 냉동 모기 시체 중 하나를 사용 하 여. 얼음에 냉동된 모기 녹여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 µ L에 개별 모기를 배치 하 여 원유 모기 lysate를 준비 하 고 10 번 P10 피펫으로 팁 (그림 1)과 모기를 분쇄 하 여 균질. 짧게 어떤 파편 든 지 작은 lysate 원유 원심. 상쾌한을 사용 하 여 다운스트림 RT 램프 분석에 대 한.
   참고: 긍정적인 컨트롤 생성 될 수 있습니다 실험실 설정에서 여성 모기 intrathoracic microinjection를 사용 하 여 약 10³ 게놈 해당 200의 볼륨에 바이러스의 감염에 의해 nL와 수확 모기 5 일 후 감염입니다.

3. 준비 RT 램프 마스터 믹스

1. 표 3에 볼륨 가이드를 사용 하 여 사용 하도록 설정 하는 각 뇌관을 위한 얼음에 RT 램프 마스터 혼합 반응 준비.
   참고: 사용 thermolabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)의 가양성 방지에 도움이 됩니다.
2. 소용돌이 모든 샘플 잘 혼합, 되도록 짧게 다음 스핀 아래로 짧게 볼륨 손실을 방지 하기 위해.

4. RT-램프 분석 결과

1. 피펫으로 23.0 µ L 당 200 µ L PCR 튜브에 반응 RT 램프 마스터 믹스의. 샘플 (소변, 혈 청, 또는 2 단계에서에서 설명한 대로 원유 모기 lysate 상쾌한)의 2.0 µ L를 추가 합니다. 이 RT 램프 반응 당 25.0 µ L을 총 볼륨을 가져올 것 이다. 부정적인 컨트롤에 대 한 분자 수준의 물을 사용 합니다. 긍정적인 통제를 포함 합니다.
   참고: PCR 표준 또는 바이러스 감염 된 세포의 상쾌한에서 주식 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
   1. 선택 사항: 뎅기열 바이러스 (DENV) 관련된 arbovirus의 특이성 제어 반응 포함. 샘플 유형 2 단계에에서 설명 된 대로 샘플을 준비 합니다. 200 µ L PCR 튜브에 RT 램프 마스터 믹스의 23.0 µ L를 특이성 컨트롤의 2.0 µ L를 추가 합니다.
2. 열 블록, 물 목욕, 또는 thermocycler를 사용 하 여 30 분 동안 61 ° C에서 샘플을 열.
3. 십 분 동안 80 ° C에 난방으로는 중 합 효소 비활성화.

5. 실시간 램프 분석

참고: 별도, 밀폐 된 공간에서 실시간 램프 분석을 수행 합니다.

1. 부 화 후 색상 변경의 존재에 대 한 보고 RT 램프 반응을 시각적으로 액세스.
   1. 태 (40 m m 20 m m 초 산, 트리 스 1 mM EDTA) 버퍼에 형광 핵 산 염색 1시 10분 희석.
      주의: 모든 핵 산 얼룩 핵 산 한다 따라서 발암 물질 이다. 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다.
   2. RT-램프 반응의 12 µ L, 2 µ L 형광 핵 산 염료 희석의 추가.
      주: 부정적인 반응을 오렌지 컬러로 되며 긍정적인 반응을 노란색/녹색 색깔에 있을 것입니다.
   3. 선택 사항: 카메라를 사용 하 여 흰색 배경에 RT 램프 반응의 사진을 찍을.
2. 302 nm 자외선 아래 샘플 빛 형광에 의해 RT 램프 제품의 존재를 확인을 배치 합니다. 카메라를 사용 하 여 결과의 그림을 가져가 라.
   참고: 긍정적인 RT-램프 반응 형광 출력을 해야한다.
   주의: UV 빛을 작업할 때 UV 보호 눈 구글 또는 얼굴 방패를 착용.
3. 선택 사항: 샘플에 젤 전기 이동 법을 수행 하 여 RT-램프 제품의 존재를 확인 합니다.
   1. 시각화를 위한 핵 산 얼룩으로 1 x TAE 버퍼에는 2 %agarose 젤을 붓는 다.
      주의: 모든 핵 산 얼룩 핵 산 한다 따라서 발암 물질 이다. 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다.
   2. 분자 무게를 비교 하 여 첫 번째 차선에 DNA 사다리의 5 µ L를 추가 합니다.
   3. 각 램프 RT 반응에 대 한 염료를 로드 하는 DNA의 2 µ L 13 µ L RT 램프 반응 혼합물의 혼합. 염료를 로드 하는 DNA를 포함 하는 15 µ L 혼합물을 로드 합니다.
   4. 302 nm 자외선과 90 V 90 분 또는 때까지 밴드 분리 젤과 이미지를 실행 합니다.
      참고: 긍정적인 RT-램프 반응 laddering 패턴을 있을 것 이다. 네거티브 RT 램프 반응에는 어떤 밴드 없어야 합니다.

6입니다. 처리

1. 이중 밀폐 봉지에 RT 램프 반응의 처분. 할 하지 압력솥이 미래에 거짓 긍정적인 반응을 이끌어 RT 램프 제품 aerosolize 수 있습니다.

결과

RT-램프 반응 3 가지 방법을 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 첫째, 형광 핵 산 염료의 추가 함께 긍정적인 반응이 됩니다 노란색/녹색 색상에 부정적인 반응을 오렌지 육안으로 색상에 나타납니다. 둘째, RT 램프 반응 형광 핵 산 염료의 추가에 결과 형광 신호 샘플 UV 빛에 의해 흥분. 부정적인 반응을 소량 부정적인 컨트롤에 있을 수 있는 모든 배경 형광에 감지 형광 신호를...

토론

ZIKV RT-램프 분석 결과 인간과 모기 샘플⁶을 사용 하 여이 종이 작품에 설명 된. 탐지의 한계는 약 1 게놈에 해당⁶, 증상 ZIKV 감염 환자의 일반적인 바이러스 부하 이기 때문에 10 충분 해야³  10⁶ PFU/mL⁷. 또한,이 방법은 ZIKV 샘플 먼저 분리 RNA와 세포 배양에서 바이러스 증폭 없이 검색할 수 있습니다. 이 크게 시간, 비용, 및 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A