JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает эффективный и недорогой способ обнаружить вирус Зика или контролировать цели в образцах мочи и сыворотки или комаров, обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа). Этот метод не требует РНК изоляции и может быть сделано в течение 30 мин.

Аннотация

Заражение вирусом Зика (ZIKV) может быть бессимптомным у взрослых, однако, инфекции во время беременности может привести к выкидышу и тяжелых неврологических врожденных дефектов. Цель настоящего Протокола заключается в быстро обнаружить ZIKV в образцах человека и комаров. Текущий золотой стандарт для обнаружения ZIKV является количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР); Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) может позволить для более эффективных и недорогостоящих тестирования без необходимости дорогостоящего оборудования. В этом исследовании RT-лампа используется для обнаружения ZIKV в различных биологических образцов в течение 30 мин, без первой изолировать РНК из образца. Этот метод показан с помощью ZIKV инфицированных пациентов мочи и сыворотки и инфицированных комаров образцы. 18s рибосомных рибонуклеиновой кислоты и актина используются в качестве элементов в образцах человека и комаров, соответственно.

Введение

В 2015 году Зика вирус (ZIKV) получил видные глобального внимания как инфекционное заболевание озабоченность, поскольку инфекции во время беременности был связан с выкидыш, мертворождение, тяжелые неврологические врожденных дефектов, включая микроцефалия, а также другие врожденные врожденные дефекты1. В редких случаях ZIKV был связан с синдром Гийена-Барре. ZIKV преимущественно передается комарами Aedes ; Однако он также может распространяться через половой контакт1. Учитывая, что инфекции с ZIKV протекает бессимптомно у большинства людей или подарки с мягким гриппоподобные симптомы, которые совпадают с симптомами инфекции других arborviruses1, существует необходимость совершенствования методов для быстрого и экономически обнаружения ZIKV на экран как людей, так и местных комаров населения.

Количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР) является надежным методом для обнаружения ZIKV; Однако этот метод требует дорогостоящее специализированное оборудование, квалифицированного персонала и изоляции РНК из образца интерес. Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) является одношаговый метод амплификации нуклеиновых кислот, основанный на технологии PCR, которая требует только одной температуры инкубации за счет использовании теплолюбивых ДНК-полимеразы с нити Перемещение свойств. Это обходит необходимость Термоциклер и уменьшает продолжительность времени, необходимого для завершения анализа. Дополнительные преимущества RT-Лампа высокая специфичность и чувствительность, надежность в диапазоне рН и температуры и сопротивление многих ПЦР ингибиторы2. Он имеет сравнительно низкую стоимость и реагенты стабильны при комнатной температуре. Учитывая эти характеристики, RT-лампа может быть развернут в лаборатории или в поле. Таким образом лампа реакции были разработаны для обнаружить широкий спектр патогенов и других видов инфекции3,4,5. Цель протокола RT-лампа, описанных в данном документе является обнаружить ZIKV без изоляции РНК в человеческой сыворотки и мочи образцов, а также как единый инфицированных комаров в течение 30 мин через RT-лампа. Этот метод может использоваться для замены qRT-PCR как это чувствительной, быстрое диагностический инструмент, который работает быстро и в настройках вне лаборатории.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены организационного обзора (КИБ) Beaumont здоровья. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил.

Предупреждение: Все потенциально инфекционные материалы должны обрабатываться согласно стандартам 2-го уровня биобезопасности, включая использование средств индивидуальной защиты. Любые процедуры, которые могут производить аэрозоля должны выполняться в биобезопасности кабинета. Кроме того работа с живой комаров должны выполняться в соответствующее медицинское учреждение членистоногих сдерживания уровня 1-3. Учитывая ассоциации ZIKV инфекции с врожденными аномалиями, беременные женщины, пытающаяся зачать, или партнеров этих женщин должны значительно минимизации их лаборатории ZIKV. Транспортировка образцов ZIKV классифицируется в Соединенных Штатах как биологические вещества категории B в соответствии с Департамента перевозки опасных материалов правил (49 CFR часть 171-180) и поэтому доставка образцов следует придерживаться тех руководящие принципы. Импорт в Соединенные Штаты Америки ZIKV biospecimens требует центров для борьбы с болезнями и профилактике болезней (ЦББ) разрешение на импорт. Импорт любых членистоногих, которые могли бы служить в качестве вектора для ZIKV передачи, даже если они не инфицированы, требуется разрешение министерства сельского хозяйства США (USDA). Эта информация является текущим на момент публикации. Современные рекомендации можно найти на https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

Примечание: RT-лампа реакции склонны к более высокий уровень ложных положительных реакций, поэтому меры предосторожности должны быть приняты в экспериментальной планирования. Все настройки и выполнения RT-лампа реакций следует использовать назначенный пипетки и фильтр советы. В идеале следует установить боковые рабочего потока. Если возможно анализа и обработки изображений (раздел 5) должно происходить в отдельном закрытом помещении для предотвращения загрязнения. Открытия пробирки, содержащие RT-лампа продукты должны быть сведены к минимуму.

1. RT-лампа грунтовка подготовка

  1. Воссоздать каждый лиофилизированные RT-лампа грунт в воде молекулярные класса до конечной концентрации 100 мкм (Таблица 1). Кратко вихрь грунтовочный раствор для обеспечения однородного раствора и кратко вращаться вниз решение на максимальной скорости в центрифугу столешницы для сбора всех грунтовочный раствор.
  2. Подготовка 10 x RT-лампа грунтовка смесь FIP, BIP, F3, B3, LF и LB грунтовки с помощью томов в таблице 2. Кратко вихрь грунтовочный раствор обеспечить однородный раствор, и кратко вращаться вниз решение на максимальной скорости в центрифугу столешницы, чтобы избежать любой потери.
    Примечание: RT-лампа грунтовка для А.е. aegypti актина (AEDAE) не содержат LB грунтовка (петля праймеры не всегда необходимые для реакции RT-лампа). В этом случае замените объем грунтовка LB с молекулярного уровня воды.
  3. Хранить грунты при-20 ° C между использованиями и избежать циклов оттаивания бесплатно.

2. Пробоподготовка

  1. Для образцов мочи человека: Использование свежей мочи, замороженные моча или моча в консервант. Для свежего или замороженного образца: немедленно спин вниз образца после сбора за 10 мин на 700 x gи использовать супернатант для анализа или заморозить при температуре-80 ° C для использования в будущем. Оттепель замороженных образцов на льду перед использованием.
  2. Для образцов сыворотки крови человека: Используйте образцы либо свежие или замороженные сыворотки.
  3. Для ZIKV инфицированных клеток линии: использовать кондиционерами СМИ или lysates клетки.
    Примечание: Бесплатный сотовый кондиционером СМИ из А.е. albopictus C6/36 клетки 8 дней после инфицирования может использоваться как позитивные элементы управления для ZIKV RT-лампа реакций.
  4. Для А.е. aegypti комаров: использовать либо весь свежий или замороженный комаров туши. Оттепель замороженных комаров на льду. Подготовка сырой комаров lysate, поместив в 100 мкл фосфат амортизированное saline (PBS) отдельных Москито и гомогенизации путем дробления комаров 10 раз с кончиком пипетки P10 (рис. 1). Кратко центрифуга сырой lysate Пелле любой мусор. Используйте супернатант течению RT-лампа анализа.
    Примечание: Позитивные элементы управления могут быть получены в лабораторных условиях путем заражения женщин комаров с помощью внутригрудного микроинъекции с приблизительно 103 эквиваленты генома вируса в объеме 200 nL и уборки комаров 5 дней послеоперационные инфекции.

3. Подготовка мастер RT-лампа микс

  1. Подготовка мастер смесь реакции RT-лампа на льду для каждого праймера, набор для использования с помощью руководство тома в таблице 3.
    Примечание: Использование термолабильных урацила ДНК Glycosylase (UDG) помогает в предотвращении ложных срабатываний.
  2. Вихревой кратко, чтобы обеспечить, что все образцы хорошо смешиваются, то спина вниз кратко для предотвращения потери объема.

4. RT-лампа Assay

  1. Накапайте 23,0 мкл RT-лампа мастер смесь реакции в ПЦР-пробирку 200 мкл. 2,0 мкл пример (моча, сыворотки или сырой комаров lysate супернатанта как описано в шаге 2). Это позволит довести общий объем 25,0 мкл в реакции RT-лампа. Для отрицательного контроля использования молекулярного уровня воды. Включают позитивные элементы управления.
    Примечание: ПЦР стандарт или вирус запасов от супернатант зараженных клеточных линий может использоваться как позитивный элемент управления.
    1. Дополнительно: Включают специфику управления реакции соответствующих арбовирусных например вирус денге (DENV). Подготовка образца, как указано в шаге 2 согласно образец типа. Мкл 2.0 Специфика управления в 23.0 мкл RT-лампа мастер смеси в ПЦР-пробирку 200 мкл.
  2. Тепло образцы на 61 ° C в течение 30 мин, с использованием теплового блока, водяная баня или Термоциклер.
  3. Тепла деактивировать полимеразы путем нагрева до 80 ° C в течение 10 мин.

5. RT-лампа анализ

Примечание: Анализ RT-лампа в отдельный, замкнутые пространства.

  1. После инкубации доступ к реакции RT-лампа визуально, посмотрев на наличие изменения цвета.
    1. Разбавьте 1:10 краска люминесцентные нуклеиновых кислот в буфер TAE (40 мм трис, 20 мм уксусная кислота, ЭДТА 1 мм).
      Предупреждение: Любой пятен нуклеиновой кислоты связывает нуклеиновых кислот и таким образом является канцерогеном. Надевайте перчатки при обработке.
    2. Для 12 мкл реакции RT-лампы 2 мкл разбавления краска люминесцентные нуклеиновых кислот.
      Примечание: Негативные реакции будет оранжевый цвет и позитивные реакций будет жёлто/зелёного цвета.
    3. Дополнительно: Сфотографировать RT-лампа реакций на белом фоне с помощью камеры.
  2. Поместите образцы под 302 Нм УФ света подтвердить присутствие продуктов RT-лампы флуоресценции. Сделайте снимок с помощью камеры результата.
    Примечание: Реакции положительные RT-лампа будет иметь флуоресцентный выход.
    Предупреждение: Носить UV защитные глаз googles или лица щит при работе с ультрафиолетовым светом.
  3. Дополнительно: Подтверждают наличие товаров RT-лампа, выполняя электрофорез геля на образцах.
    1. Вливают 2% гель агарозы 1 x TAE буфер с нуклеиновой кислоты пятно для визуализации.
      Предупреждение: Любой пятен нуклеиновой кислоты связывает нуклеиновых кислот и таким образом является канцерогеном. Надевайте перчатки при обработке.
    2. 5 мкл лестница ДНК, в первой полосе для сравнения молекулярным весом.
    3. Для каждой реакции RT-лампа смесь 13 мкл реакционной смеси RT-лампа с 2 мкл ДНК загрузки красителя. Загрузите 15 мкл смесь, содержащую ДНК, Загрузка красителя.
    4. Запустите геля на 90 V 90 мин, или до тех пор, пока полосы отделены и изображения с 302 Нм УФ света.
      Примечание: Реакции положительные RT-лампа будет иметь разрыв шаблона. Негативной реакции RT-лампа не должен содержать каких-либо групп.

6. Утилизация

  1. Распоряжаться RT-лампа реакций в двойной герметичные мешки. Сделать не автоклава, как это может aerosolize RT-лампа продукции, приводит к ложных положительных реакций в будущем.

Результаты

RT-лампа реакции могут быть проанализированы с использованием трех различных методов. Во-первых с добавлением краски флуоресцентные нуклеиновых кислот, позитивные реакций будет желтый/зеленый цвет где негативной реакции будут отображаться оранжевый цвет невооружен?...

Обсуждение

Пробирная ZIKV RT-лампа, описанные в этой бумаге работ с использованием как человека, так и комаров образцы6. Предел обнаружения был примерно 1 генома эквивалент6, которое должно быть достаточно, поскольку типичная вирусная нагрузка симптоматическим ZIKV инфицирова...

Раскрытие информации

Лель и МБК имеют интеллектуальной собственности на Зика методов диагностики вируса. Остальные авторы имеют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана Морин и Рональд Хирш семейный благотворительный вклад и области нейронаук институт, Святой Марии штата Мичиган. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Мы также благодарим д-р Бернадетт Zwaans и Илия Уорд за их критического обзора рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymeraseNew England BiolabsM0537S
Isothermal Amplification Buffer New England BiolabsB0537S
WarmStart RTx Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0380S
Antarctic Thermolabile UDGNew England BiolabsM0372S
MgSO4New England BiolabsB1003S
100 mM dATP SolutionNew England BiolabsN0440SDeoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP SolutionNew England BiolabsN0441SDeoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP SolutionNew England BiolabsN0443SDeoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP SolutionNew England BiolabsN0442SDeoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP SolutionThermo Fisher ScientificR0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainInvitrogenS7563
Nancy-520Sigma Aldrich01494
Low DNA Mass LadderInvitrogen10-068-013
Zika Postive ControlRobert Koch Institute, GermanyN/A
AgaroseThermo Fisher ScientificBP1600
BlueJuice Gel Loading BufferInvitrogen10816015
PrimersIntegrated DNA TechnologiesCustom Oligo
Nuclease-Free WaterAmbionAM9938
Urine PreservativeNorgen Biotek18126
ZIKV PCR StandardRobert Koch InstituteN/AVero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C ControlConnecticut Agricultural Experiment StationN/A

Ссылки

  1. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
  2. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  3. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
  4. Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
  5. Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
  7. Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
  8. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  9. Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
  10. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
  11. Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
  12. Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
  13. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  14. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  15. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  16. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  17. Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

139RTAedes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены