İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Özet

Bu iletişim kuralı Zika virüs tespit veya hedefleri insan serum ve idrar örnekleri veya sivrisinekler Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon tarafından (RT-lamba) denetlemek için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu yöntem does değil istemek RNA izolasyon ve 30 dk içinde yapılabilir.

Özet

Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon yetişkinlerde asemptomatik olabilir, ancak, gebelik sırasında enfeksiyon çocuk düşürme ve ağır nörolojik Doğum kusurları yol açabilir. Bu iletişim kuralı, hızlı bir şekilde insan ve sivrisinek ZIKV algılamak için hedeftir. ZIKV algılama için geçerli altın standart olduğunu nicel Ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR); Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (RT-lamba) bir daha verimli ve düşük maliyetli pahalı ekipmanlara gerek kalmadan test etmek için izin verebilir. Bu çalışmada, RT-lamba ZIKV algılama 30 dk içinde çeşitli biyolojik örneklerde için ilk örnekten RNA izole olmadan kullanılır. Bu tekniği kullanarak ZIKV hasta idrar ve serum enfekte ve sivrisinek örnekleri enfekte gösterilmiştir. 18s ribozomal ribonükleik asit ve aktin insan ve sivrisinek örnekleri, denetimler olarak sırasıyla kullanılır.

Giriş

Gebelik sırasında enfeksiyon bağlı için düşük, distres, microcephaly, hem de diğer konjenital dahil olmak üzere ağır nörolojik Doğum kusurları için 2015 yılında Zika virüs (ZIKV) önde gelen küresel dikkat endişe bulaşıcı bir hastalık olarak elde Doğum kusurları¹. Nadir de olsa bazen ZIKV Guillain-Barré sendromu ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. ZIKV öncelikle Aedes sivrisinekler tarafından iletilir; Ancak, bu da cinsel temas¹ile yayılır. Verilen bu ZIKV enfeksiyonla insanların çoğu asemptomatik veya diğer arborviruses¹enfeksiyon belirtileri olan üst üste hafif grip benzeri belirtiler sunar, hızlı ve düşük maliyetli algılanması için gelişmiş yöntemler için bir ihtiyaç vardı Hem insanlar hem de yerel sivrisinek nüfus ekran ZIKV.

Nicel Ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) ZIKV algılama için güvenilir bir tahlil olduğunu; Ancak, bu teknik pahalı özel ekipman, eğitimli personel ve örnek RNA izolasyonu ilgi gerektirir. Ters transkripsiyon döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (RT-lamba) sadece bir kuluçka sıcaklık iplikçik ile termofilik DNA polimeraz kullanımı nedeniyle gerektirir PCR teknolojisi tabanlı bir tek adımlı nükleik asit amplifikasyon yöntemdir yer değiştirme özellikleri. Bu bir thermocycler ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve tahlil tamamlamak için gereken süreyi azaltır. RT-lamba ek avantajları şunlardır onun yüksek özgüllük ve hassasiyet, pH seviyeleri ve sıcaklıklar ve birçok PCR inhibitörleri²direnç bir mesafeden sağlamlık. Reaktifler oda sıcaklığında kararlı ve nispeten düşük maliyet vardır. Bu özellikleri göz önüne alındığında, RT-lamba bir laboratuvar veya alana dağıtılabilir. Bu nedenle, lamba tepkiler çeşitli patojenler ve diğer tür enfeksiyon^3,4,5algılamak için geliştirilmiştir. Bu raporda açıklanan RT-lamba Protokolü amacı RNA izolasyon insan serum ve idrar örneklerinde de RT-lamba üzerinden 30 dk içinde tek bir virüslü sivrisinek gibi olmadan ZIKV tespit etmektir. Bu yöntem hızlı bir şekilde ve ayarları laboratuvar dışında çalışır bir duyarlı, hızlı tanı aracı olarak qRT-PCR değiştirmek için kullanılabilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) Beaumont sağlık tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde yapıldı.

Dikkat: Tüm potansiyel bulaşıcı malzemeler kişisel koruyucu ekipman kullanımı da dahil olmak üzere seviye 2 standartlarına göre ele alınmalıdır. Aerosol üretebilir tüm yordamlar bir Biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. Ayrıca, çalışma canlı sivrisinek ile uygun eklem bacaklılar koruma düzey 1-3 tesisinde gerçekleştirilmelidir. Konjenital anormallikler ile ZIKV enfeksiyon Derneği göz önüne alındığında, gebe kalmaya çalışan hamile kadınlar veya bu kadınlar ortaklarının önemli ölçüde ZIKV laboratuvar maruz kaldıkları en aza indirmek gerekir. ZIKV örnekleri taşıma Amerika Birleşik Devletleri'nde Kategori B biyolojik maddeler uyarınca bölümü ulaşım tehlikeli malzemeler düzenlemeler olarak sınıflandırılmış (49 CFR bölüm 171-180) ve bu nedenle örnekleri sevkiyat için uygun yönergeleri. ZIKV Amerika Birleşik Devletleri biospecimens içe aktarma işlemi bir merkezleri hastalık kontrol ve önleme (CDC) ithalat izni gerektirir. Onlar bulaşmamış olsa bile, bir vektör ZIKV iletimi için bir ABD Tarım Bakanlığı (USDA) gerektirdiği hizmet verebilecek herhangi bir Artropodların ithalat izni. Bu bilgiler yayın sırasında geçerli olur. Güncel öneriler https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html bulunabilir.

Not: deneysel planlamasında önlemler alınmalıdır böylece RT-lamba reaksiyonlar yanlış olumlu tepkiler, daha yüksek oranda yatkındır. Tüm kurulum ve RT-lamba reaksiyonlar yürütülmesini belirlenen Pipetler ve filtre ipuçları kullanmanız gerekir. İdeal olarak, bir yan iş akışı kurulmalıdır. Mümkünse, analiz ve (Bölüm 5) görüntüleme kontaminasyonu önlemek için ayrı bir kapalı odada gerçekleşmelidir. Test tüpleri RT-lamba ürünleri içeren açılışı minimumda tutulmalıdır.

1. RT-lamba astar hazırlama

1. Her lyophilized RT-lamba astar moleküler sınıf su 100 µM (Tablo 1) son bir konsantrasyon için yeniden oluşturma. Kısaca astar çözüm homojen bir çözüm sağlamak ve kısaca çözüm tüm astar çözüm toplamak için bir masa üstü santrifüj maksimum hızda aşağı spin girdap.
2. Hazırlamak bir 10 x RT-lamba Tablo 2' de birimleri kullanma FIP, BIP, F3, B3, Eğer ve LB astar astar karışımı. Kısaca astar çözüm homojen bir çözüm sağlamak ve kısa bir süre içinde herhangi bir kaybı önlemek için bir masa üstü santrifüj maksimum hızda çözüm aşağı spin girdap.
   Not: Ae. aegypti aktin (AEDAE) için ayarla RT-lamba astar LB astar içermiyor (döngü astar her zaman RT-lamba reaksiyonlar için gerekli değildir). Bu durumda, LB astar birim moleküler sınıf su ile değiştirin.
3. Astar kullanır arasında-20 ° C'de depolayın ve ücretsiz-çözülme döngüsü önlemek.

2. numune hazırlama

1. İnsan idrar numuneleri için: Taze idrar, donmuş idrar veya idrar koruyucu kullanın. Taze veya dondurulmuş örnek için: hemen koleksiyon için vasıl 700 x g, 10 dk sonra örnek spin ve süpernatant analizi için kullanın veya ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak. Kullanmadan önce buzda donmuş numuneler çözülme.
2. İnsan serum numuneleri için: Her iki taze veya dondurulmuş serum numuneleri kullanın.
3. ZIKV için hücre hatları enfekte: klimalı ortamları veya hücre lysates kullanın.
   Not: Boş hücre Ae medyadan şartına. albopictus C6/36 hücreleri 8 gün sonrası enfeksiyon olumlu denetimleri ZIKV RT-lamba reaksiyonlar için kullanılabilir.
4. Ae. aegypti sivrisinek için: ya da tamamen taze veya dondurulmuş sivrisinek leşleri kullanın. Buzda donmuş sivrisinekler çözülme. Ham sivrisinek lysate fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 100 µL içinde bireysel bir sivrisinek koyarak hazırlamak ve 10 kez P10 damlalıklı ucu (Şekil 1) ile sivrisinek kırma tarafından homojenize. Kısa bir süre herhangi bir enkaz cips lysate ham santrifüj kapasitesi. Süpernatant aşağı akım RT-lamba çözümleme için kullanın.
   Not: Pozitif denetimleri bir laboratuvar ortamında dişi sivrisinekler yaklaşık 10³ genom virüs 200 birimindeki karşılıkları ile intratorasik mikroenjeksiyon kullanarak bulaşmasını tarafından oluşturulabilir nL ve sivrisinek 5 gün hasat sonrası enfeksiyon.

3. hazırlayın RT-lamba Master Mix

1. Buz bir RT-lamba ana mix tepki her astar Tablo 3' te toplu Kılavuzu kullanarak kullanılacak ayarlamak için hazır olun.
   Not: Kullanım thermolabile urasil DNA Glycosylase (UDG), yanlış pozitif önlemede yardımcı olur.
2. Kısaca tüm örneklerini de karıştırılır sağlamak için girdap sonra spin aşağı kısaca güç kaybını önlemek için.

4. RT-lamba tahlil

1. Damlalıklı 23.0 µL tepki 200 µL PCR tüp içine başına RT-lamba ana karışımı. 2.0 µL örneği (idrar, serum veya ham sivrisinek lysate süpernatant 2. adımda açıklandığı gibi) ekleyin. Buna 25,0 µL RT-lamba tepki başına toplam hacim getirecek. Negatif kontrol için moleküler sınıf su kullanın. Olumlu bir denetim içerir.
   Not: Bir PCR standart veya virüs stokları süpernatant enfekte hücre hatları üzerinden olumlu bir denetim olarak kullanılabilir.
   1. İsteğe bağlı: ilgili Abdovirüs dang virüs (DENV) gibi bir özgüllüğü denetim reaksiyon içerir. Örnek örnek türüne göre adım 2'de açıklandığı şekilde hazırlayın. Özgüllük denetiminin 2.0 µL 23.0 µL 200 µL PCR tüp içine RT-lamba ana karışımı ekleyin.
2. Örnekleri için ısı blok, su banyosu veya thermocycler kullanarak 30 dk 61 ° C'de ısı.
3. Isı devre dışı bırakmak ve polimeraz ile 80 ° C arasında 10 dk Isıtma tarafından.

5. RT-lamba Analizi

Not: Ayrı, kapalı alanda RT-lamba çözümlemesi gerçekleştirin.

1. Kuluçka sonra RT-lamba reaksiyonlar görsel olarak bir renk değişikliği varlığı için bakarak erişin.
   1. Floresan nükleik asit boya 1:10 TAE (40 mM Tris, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) arabelleği sulandırmak.
      Dikkat: Herhangi bir nükleik asit leke nükleik asitler için bağlar ve bu nedenle bir kanserojen. İşlerken eldiven.
   2. İçin 12 µL RT-lamba tepki floresan nükleik asit boya seyreltme 2 µL ekleyin.
      Not: Olumsuz tepkiler turuncu renkte olacak ve olumlu tepkiler sarı/yeşil renkte olacak.
   3. İsteğe bağlı: bir kamera ile beyaz bir arka plan üzerinde RT-lamba reaksiyonlar fotoğraf çekmek.
2. 302 nm UV altında örnekleri floresans tarafından RT-lamba ürünleri varlığını doğrulamak ışık yerleştirin. Bir kamera ile sonuç resmini çek.
   Not: Pozitif RT-lamba reaksiyonlar floresan bir çıkış olacak.
   Dikkat: UV koruyucu göz googles ya da yüz kalkan UV ışığı ile çalışırken giyiyorum.
3. İsteğe bağlı: RT-lamba ürün örnekleri üzerinde jel elektroforez gerçekleştirerek onaylayın.
   1. 1 x TAE arabellek görüntüleme için bir nükleik asit leke ile % 2 özel jel dökmek.
      Dikkat: Herhangi bir nükleik asit leke nükleik asitler için bağlar ve bu nedenle bir kanserojen. İşlerken eldiven.
   2. Bir DNA merdivenin 5 µL moleküler ağırlık karşılaştırmak için ilk şeritte ekleyin.
   3. Her RT-lamba tepki için RT-lamba tepki karışımı 13 µL boya yükleme DNA 2 µL ile karıştırın. Boya yükleme DNA içeren 15 µL karışımı yerleştirin.
   4. Jel 90 V 90 dk ya kadar bantları ayrılır ve görüntü 302 nm UV ışık ile çalıştırın.
      Not: Pozitif RT-lamba reaksiyonlar laddering bir model olacaktır. Olumsuz RT-lamba tepkiler hiç grup içermemesi gerekir.

6. elden çıkarma

1. RT-lamba reaksiyonlar çift mühürlü torbalar içinde atın. Bu yanlış pozitif tepkiler gelecekte önde gelen RT-lamba ürünleri yaymakolduğunu değil otoklav yap.

Sonuçlar

RT-lamba reaksiyonlar üç farklı yöntem kullanılarak çözümlenebilir. İlk olarak, bir floresan nükleik asit boya eklenmesiyle, olumlu tepkiler olumsuz tepkiler turuncu renkli çıplak gözle görüneceği yeri sarı/yeşil renkte olacaktır. İkinci olarak, floresan nükleik asit boya RT-lamba tepki için ek floresan sinyal oluşur örnekleri UV ışığıyla heyecanlı mısın. Olumsuz tepkiler algılanabilir bir floresan sinyal negatif kontrol küçük miktarlarda mevcut olabili...

Tartışmalar

Bu kağıt işler insan ve sivrisinek örnekleri⁶kullanarak açıklanan ZIKV RT-lamba tahlil. Semptomatik enfekte ZIKV hastanın normal viral yük 10 olduğundan yeterli olacaktır yaklaşık 1 genom eşdeğer⁶, algılama sınırı olduğunu³ ' e 10⁶ PFU/mL⁷. Ayrıca, bu yöntem ilk izole RNA ve hücre kültüründe virüsü amplifikasyon olmadan örneklerdeki ZIKV algılayabilir. Bu önemli ölçüde zaman, maliyet ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A