反向转录-环介导的等温放大 (RT 灯) 测定尿液、血清和蚊子标本中的 Zika 病毒和管家基因

摘要

该协议提供了一种高效、低成本的方法, 用于检测人体尿液、血清样品或蚊子中的 Zika 病毒或控制靶, 采用反向转录环介导的等温放大 (RT 灯)。此方法不需要 RNA 隔离, 可以在30分钟内完成。

摘要

感染 Zika 病毒 (ZIKV) 可能是无症状的成人, 但是, 在怀孕期间感染可能导致流产和严重的神经系统出生缺陷。该协议的目标是快速检测人类和蚊子样本中的 ZIKV。目前 ZIKV 检测的金标准是定量反向转录 pcr (qRT pcr);反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 可能允许更有效和低成本的测试, 而不需要昂贵的设备。在本研究中, RT 灯用于在30分钟内在各种生物样品中 ZIKV 检测, 而不首先从样品中分离出 RNA。这种技术是使用 ZIKV 感染的病人尿液和血清, 以及感染的蚊子样本。18S. 核糖体核糖核酸和肌动蛋白分别用作人体和蚊子标本的对照。

引言

在 2015年, Zika 病毒 (ZIKV) 作为一种传染性疾病引起了全球瞩目, 因为怀孕期间的感染与流产、死胎、严重的神经系统先天缺陷 (包括小头) 以及其他先天性出生缺陷¹。在极少数情况下, ZIKV 与格林-巴利综合征有关。ZIKV 主要由白纹蚊传播;然而, 它也可以通过性接触传播¹。鉴于感染 ZIKV 的人在多数人中无症状, 或出现轻度流感样症状, 与其他 arborviruses¹感染的症状重叠, 因此需要改进方法, 快速和经济高效地检测ZIKV, 以筛查人和当地蚊子的数量。

定量反向转录 pcr (qRT pcr) 是一种可靠的 ZIKV 检测方法;然而, 这种技术需要昂贵的专业设备, 训练有素的人员, 和 RNA 分离从样本的兴趣。反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 是一种基于 PCR 技术的一步核酸扩增方法, 它只需要一个孵化温度由于使用了嗜热 DNA 聚合酶与链位移特性。这就绕过了对 thermocycler 的需要, 减少了完成化验所需的时间长短。RT 灯的其他优点包括其高度特异性和灵敏度, 在 pH 水平和温度范围内的鲁棒性, 以及对许多 PCR 抑制剂²的抗性。它的成本相对较低, 试剂在室温下稳定。鉴于这些特点, RT 灯可以部署在实验室或现场。因此, 已经开发了灯反应, 以检测一系列的病原体和其他类型的感染^3,4,5。本文所描述的 RT 灯协议的目标是检测在人体血清和尿样中没有 RNA 分离的 ZIKV, 以及通过 RT 灯在30分钟以内的单一感染蚊子。该方法可用于替代 qRT PCR, 因为它是一种灵敏的, 快速的诊断工具, 工作迅速和在实验室以外的设置。

研究方案

这里描述的所有方法都已得到博蒙特健康机构审查委员会 (IRB) 的批准。所有的实验都是按照相关的指导方针和规定进行的。

注意: 所有可能感染的材料应按照生物安全等级2标准处理, 包括使用个人防护设备。任何可能产生气溶胶的程序都应在生物安全柜中进行。此外, 应在适当的节肢动物控制1-3 级设施中进行活蚊的工作。鉴于 ZIKV 感染与先天性畸形的关系, 怀孕、试图受孕的妇女或这些妇女的伴侣应大大减少实验室对 ZIKV 的接触。根据运输部危险材料条例 (49 CFR 第171-180 部分), 在美国将 ZIKV 样品的运输分类为 B 类生物物质, 因此装运样品应遵守这些指引。进口到美国的 ZIKV biospecimens 需要一个疾病控制和预防中心 (CDC) 进口许可证。进口任何可以作为 ZIKV 传播载体的节肢动物, 即使它们没有被感染, 也需要美国农业部 (USDA) 许可证。此信息在发布时是最新的。最新的建议可以在 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html 找到。

注意: RT 灯反应易发生假阳性反应率较高, 因此在实验规划中应采取预防措施。所有的 RT 灯反应的设置和执行应使用指定的吸管和过滤器提示。理想情况下, 应建立横向工作流。如果可能的话, 分析和成像 (5 节) 应该出现在一个单独的封闭的房间, 以防止污染。应将装有 RT 灯产品的试管的开口保持在最低限度。

1. RT 灯底漆的制备

1. 在分子级水中重建每一个冻干 RT 灯底漆, 最终浓度为100µM (表 1)。简要地涡旋底漆解决方案, 以确保一个均匀的解决方案, 并简要地向下旋转的解决方案以最大速度在一个表顶离心机收集所有底漆解决方案。
2. 使用表 2中的卷, 准备 FIP、F3、B3、if 和 LB 底漆的 10x RT 灯底漆组合。简要地涡旋底漆解决方案, 以确保一个均匀的解决方案, 并简要地向下旋转的解决方案, 以最大的速度在一个表顶离心机, 以避免任何损失。
   注:蚊肌动蛋白 (AEDAE) 的 rt 灯底漆不包含 LB 底漆 (环底漆并不总是必要的 RT 灯的反应)。在这种情况下, 用分子级水代替 LB 底漆体积。
3. 将底漆存放在-20 摄氏度之间, 以避免自由解冻循环。

2. 样品准备

1. 人体尿样:在防腐剂中使用新鲜的尿液、冰冻尿液或尿液。对于新鲜或冰冻的样品: 在 700 x g处立即将样品收集10分钟后, 用上清液进行分析或冷冻-80 摄氏度以供将来使用。在使用前解冻冰冻样品。
2. 人体血清样品:使用新鲜或冰冻的血清样本。
3. 对于 ZIKV 感染的细胞系: 使用条件介质或细胞裂解物。
   注: 无细胞条件的媒体从 Ae。伊蚊 C6/36 细胞8天后感染可作为积极的控制 ZIKV RT 灯反应。
4. 蚊蚊子:使用新鲜的或冰冻的蚊子尸体。在冰上解冻冰冻的蚊子。将一只蚊子放入100µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和融汇中, 用 P10 吸管尖粉碎蚊子10次 (图 1), 准备一个粗蚊子裂解液。简单地将粗裂解物离心成颗粒。用上清液进行下游 RT 灯分析。
   注: 在实验室设置中可以产生阳性控制, 方法是通过胸腔内显微注射感染雌性蚊子, 在 200 nL 的体积内使用大约 10³基因组病毒, 并采集蚊子5天感染后。

3. 准备 RT 灯主组合

1. 在表 3中, 在冰上准备一盏 RT 灯主混合反应, 用于使用容积指南。
   注: 使用 thermolabile 尿 DNA Glycosylase (UDG) 有助于预防误报。
2. 涡流简单, 以确保所有样品混合良好, 然后简单地向下旋转, 以防止体积损失。

4. RT 灯检测

1. 吸管23.0 µL 的 RT 灯主混合每反应成一个200µL PCR 管。添加2.0 µL 的样品 (尿液, 血清, 或粗蚊子裂解上清, 如步骤2所述)。这将使总体积为25.0 µL 每 RT 灯反应。对于负控制, 使用分子级水。包括一个积极的控制。
   注: PCR 标准或病毒储存从上清的感染细胞线可以作为一个积极的控制。
   1. 可选: 包括相关虫媒病毒的特异性控制反应, 如登革病毒 (DENV)。根据示例类型, 按照步骤2中概述的方式准备示例。添加2.0 µL 的特异性控制到23.0 µL 的 RT 灯主组合成200µL PCR 管。
2. 用热块、水浴或 thermocycler 将样品加热61摄氏度30分钟。
3. 热停用聚合酶加热到80°c 10 分钟。

5. RT 灯分析

注意: 在单独的封闭空间中执行 RT 灯分析。

1. 孵化后, 通过寻找颜色变化的存在, 进入 RT 灯的反应视觉。
   1. 稀释荧光核酸染料1:10 在泰 (40 毫米三, 20 毫米醋酸, 1 毫米 EDTA) 缓冲。
      注意: 任何核酸染色都与核酸结合, 因此是致癌物质。搬运时要戴上手套。
   2. 对12µL 的 RT 灯反应, 加入2µL 荧光核酸染料稀释。
      注: 阴性反应将呈橙色, 阳性反应呈黄色/绿色。
   3. 可选: 使用照相机拍摄白色背景上的 RT 灯反应。
2. 将样品放置在 302 nm 紫外线照射下, 以通过荧光来确认 RT 灯产品的存在。使用照相机拍摄结果的图片。
   注: 阳性的 RT 灯反应将有荧光输出。
   注意: 使用紫外线防护眼谷歌或面罩时, 使用 uv 光。
3. 可选: 通过对样品进行凝胶电泳, 确认 RT 灯产品的存在。
   1. 将2% 琼脂糖凝胶倒入1x 泰的缓冲器中, 用核酸染色进行可视化。
      注意: 任何核酸染色都与核酸结合, 因此是致癌物质。搬运时要戴上手套。
   2. 在第一条小巷中添加5µL 的 DNA 阶梯, 以比较分子的重量。
   3. 对于每一个 rt 灯反应, 混合13µL 的 rt 灯反应混合物与2µL DNA 负载染料。载入含有 DNA 负载染料的15µL 混合物。
   4. 在 90 V 处运行凝胶90分钟, 或直到带分离和图像与 302 nm 紫外线光。
      注意: 阳性的 RT 灯反应将有一个抽丝的模式。负 RT 灯反应不应包含任何波段。

6. 处置

1. 双密封袋中的 RT 灯反应处理。不要高压釜, 因为这可能 aerosolize 的 RT 产品, 导致错误的积极反应在未来。

结果

可以用三种不同的方法分析 RT 灯的反应。首先, 随着荧光核酸染料的加入, 阳性反应将呈黄色/绿色, 在这种颜色中, 阴性反应会呈橙色到肉眼的颜色。第二, 将荧光核酸染料添加到 RT 灯反应中, 当样品被紫外光激发时, 会产生荧光信号。阴性反应将不会有一个可检测的荧光信号在任何背景荧光, 可能存在的小剂量在负控制。最后, 在琼脂糖凝胶上可以用到 RT 灯的反应。阳性的...

讨论

本文所描述的 ZIKV RT 灯的研究工作使用的人和蚊子样本⁶。检测的限制约为1基因组等效⁶, 这应该是足够的, 因为典型的病毒负荷的症状 ZIKV 感染患者是 10 3 至 10⁶ PFU/毫升⁷。此外, 该方法可以检测不先分离 RNA 的样品中的 ZIKV, 细胞培养中不存在病毒放大。与 qRT PCR 相比, 这大大降低了这种检测的时间、成本和健康风险。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A