Reverse Transkription-Loop-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) Assay für Zika-Virus und Housekeeping-Gene in Urin, Serum und Moskito-Proben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine effiziente und kostengünstige Methode zum Zika Virus erkennen oder steuern Ziele im menschlichen Urin und Serum-Proben oder Mücken durch reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Amplifikation (RT-Lampe). Diese Methode erfordert keine RNA isoliert und kann innerhalb von 30 Minuten erfolgen.

Zusammenfassung

Infektion mit Zika-Virus (ZIKV) kann bei Erwachsenen asymptomatisch sein, jedoch Infektion während der Schwangerschaft kann zu fehl- und schwere neurologische Geburtsschäden führen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ZIKV in Menschen- und Moskito Proben schnell zu erkennen. Der derzeitige Goldstandard für ZIKV Erkennung ist quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR); reversen Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) kann für eine effiziente und kostengünstige Prüfung ohne die Notwendigkeit für teure Ausrüstung. In dieser Studie dient RT-Lampe ZIKV-Erkennung in verschiedenen biologischen Proben innerhalb von 30 min ohne erste Isolierung der RNS aus der Probe. Diese Technik wird gezeigt, mit ZIKV infizierten Patienten Urin und Serum und infizierten Mücke Proben. 18 s ribosomalen Ribonukleinsäure und Aktin werden als Steuerelemente in Menschen- und Moskito Proben verwendet.

Einleitung

Im Jahr 2015 sammelte Zika-Virus (ZIKV) Prominente weltweite Aufmerksamkeit als eine Infektionskrankheit von Sorge denn Infektion während der Schwangerschaft mit fehl-, Totgeburt, schwere neurologische Geburtsschäden einschließlich Mikrozephalie sowie andere angeborene verbunden war Geburtsschäden¹. In seltenen Fällen wurde ZIKV mit Guillain-Barré-Syndrom. ZIKV ist in erster Linie von Aedes -Mücken übertragen; Es kann jedoch auch durch sexuellen Kontakt¹verteilt werden. Angesichts der Tatsache, dass die Infektion mit ZIKV bei den meisten Menschen asymptomatisch ist oder präsentiert mit milden grippeähnlichen Symptomen, die sich überschneiden mit den Symptomen einer Infektion von anderen Arborviruses¹, gab es eine Notwendigkeit für bessere Methoden zur schnellen und kostengünstigen Nachweis von ZIKV sowohl Menschen als auch lokale Moskito-Populationen auf den Bildschirm.

Quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR) ist ein zuverlässiger Test zur ZIKV Erkennung; Diese Technik erfordert jedoch teure Spezialausrüstung, geschultes Personal und RNA-Isolierung aus der Stichprobe von Interesse. Reversen Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) ist eine einstufige Nukleinsäure-Amplifikation Methode basiert auf PCR-Technologie, die nur eine Inkubationstemperatur durch den Einsatz einer thermophilen DNA-Polymerase mit Strang erfordert Verschiebung-Eigenschaften. Dies umgeht die Notwendigkeit für ein Thermocycler und verringert die Länge der Zeit benötigt, um den Test abzuschließen. Weitere Vorteile des RT-Lampe sind seine hohe Spezifität und Sensitivität, Robustheit bei einer Reihe von pH-Werten und Temperaturen und Resistenz gegen viele PCR-Inhibitoren². Es hat einen relativ niedrigen Kosten und Reagenzien sind bei Raumtemperatur stabil. Angesichts dieser Merkmale, kann RT-Lampe in einem Labor oder im Feld eingesetzt werden. Als solche sind Lampe Reaktionen entwickelt worden, um eine Reihe von Krankheitserregern und anderen Arten von Infektion^3,4,5zu erkennen. Das Ziel des RT-Lampe-Protokolls, die in diesem Dokument beschriebenen ist, ZIKV ohne RNA Isolierung im menschlichen Serum und Urin Proben sowie einen einzigen infizierten Mücke innerhalb von 30 min durch RT-Lampe zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, um qRT-PCR zu ersetzen, wie es ist eine sensible, schnelle Diagnose-Tool, die schnell und in den Einstellungen außerhalb des Labors arbeitet.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden sind durch institutionelle Review Board (IRB) der Beaumont Gesundheit genehmigt worden. Alle Versuche wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Achtung: Alle potentiell infektiöse Materialien sollten nach Biosafety Level 2 Standards einschließlich der Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden. Alle Prozeduren erzeugen Aerosol sollte in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden. Darüber hinaus sollten arbeiten mit live Mücken in der entsprechenden Gliederfüßer Containment Level 1-3-Anlage durchgeführt werden. Da der Verband der ZIKV Infektion mit angeborenen Fehlbildungen, sollten Frauen, die schwanger sind, versuchen zu begreifen und die Partner dieser Frauen deutlich ihre Labor ZIKV minimieren. Transport von ZIKV Proben ist in den Vereinigten Staaten als Kategorie B biologische Substanzen entsprechend Abteilung der gefährlichen Materialien Transportvorschriften eingestuft (49 CFR Teil 171-180) und daher Versand Proben sollte auf diejenigen halten Richtlinien. Import in die Vereinigten Staaten von ZIKV bioproben erfordert ein Center für Disease Control and Prevention (CDC) Einfuhr zu ermöglichen. Import von jedem Arthropoden, die als ein Vektor für ZIKV Übertragung, auch wenn sie nicht infiziert sind, eine Genehmigung des United States Department of Agriculture (USDA erfordert) dienen könnte. Diese Informationen sind zum Zeitpunkt der Veröffentlichung aktuell. Aktuelle Empfehlungen finden Sie unter https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

Hinweis: RT-Lampe Reaktionen sind anfällig für höhere Rate der falsch positiven Reaktionen, so dass bei der experimentellen Planung Vorsichtsmaßnahmen. Alle Set-up und Durchführung der RT-Lampe Reaktionen sollten benannten Pipetten und Filtertips verwenden. Im Idealfall sollte ein seitliche Arbeitsablauf festgelegt werden. Wenn möglich, sollte in einem separaten geschlossenen Raum um Kontaminationen zu vermeiden Analyse und imaging (Abschnitt 5) auftreten. Eröffnung der Reagenzgläser mit RT-Lampe Produkte sollten auf ein Minimum gehalten werden.

(1) RT-Lampe Primer Vorbereitung

1. Bereiten Sie jedes lyophilisierter RT-Lampe Grundierung in molekularen Grade Wasser, eine Endkonzentration von 100 µM (Tabelle 1). Kurz Wirbel die Grundierung Lösung gewährleisten eine homogene Lösung und kurz spin-down die Lösung mit maximaler Geschwindigkeit in einer Table-Top-Zentrifuge, alle Primer Lösung zu sammeln.
2. Bereiten Sie eine 10 x RT-Lampe Primer Mix der FIP, BIP, F3, B3, LF und LB Primer mit den Bänden in Tabelle 2. Kurz Wirbel die Grundierung-Lösung für eine homogene Lösung zu gewährleisten, und kurz spin-down die Lösung mit maximaler Geschwindigkeit in einer Table-Top-Zentrifuge, Verluste zu vermeiden.
   Hinweis: Die RT-Lampe Grundierung set für Ae. Aegypti Aktin (AEDAE) enthält keine LB Primer (Schleife Grundierungen sind nicht immer notwendig für RT-Lampe Reaktionen). In diesem Fall ersetzen Sie die LB Grundierung Datenträger mit molekularen Grade Wasser.
3. Speichern Sie die Primer bei-20 ° C zwischen den verschiedenen Zwecken zu und vermeiden Sie frei-tau-wechseln.

2. die Probenvorbereitung

1. Für menschlichen Urinproben: Verwenden Sie frische Urin, gefrorenen Urin oder Urin in Konservierungsmittel. Für frische oder tiefgefrorene Probe: sofort spin-down der Probe nach der Sammlung für 10 min bei 700 X g, und den überstand für die Analyse verwenden oder bei-80 ° C zur späteren Verwendung einfrieren. Gefrorene Proben auf Eis vor dem Gebrauch Auftauen.
2. Für menschliches Serumproben: Verwenden Sie entweder frische oder tiefgefrorene Serumproben.
3. Für ZIKV infiziert Zelllinien: konditionierten Medien oder Zelle Lysates verwenden.
   Hinweis: Bedingt zellfreien Medien von Ae. Albopictus C6/36 Zellen 8 Tage nach der Infektion können für ZIKV RT-Lampe Reaktionen als Positivkontrollen verwendet werden.
4. Für Ae. Aegypti Moskitos: verwenden Sie entweder ganz frisch oder gefroren Moskito-Kadaver. Gefrorene Mücken auf Eis Auftauen. Bereiten Sie eine grobe Mücke lysate indem man eine einzelne Mücke in 100 µL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und homogenisieren durch Zerkleinern der Mücke 10mal mit P10 pipettieren Spitze (Abbildung 1). Kurz Zentrifugieren Sie lysate zu jeglichen Schmutz Pellets Rohöl. Verwenden Sie den überstand für die nachgelagerten RT-Lampe Analyse.
   Hinweis: Positivkontrollen können im Labor durch weibliche Stechmücken mit intrathorakalen Mikroinjektion mit ca. 10³ Genom Entsprechungen des Virus in einem Volumen von 200 Infektion erzeugt werden nL und Ernte die Mücke 5 Tage nach der Infektion.

3. bereiten Sie RT-Lampe Master Mix

1. Bereiten Sie eine RT-LAMP-master-Mix-Reaktion auf Eis für jede Grundierung mit Volumen-Führer in Tabelle 3eingesetzt werden soll.
   Hinweis: Die Verwendung von thermolabilen Uracil DNA Glycosylase (UDG) hilft bei der Fehlalarme zu verhindern.
2. Vortex kurz um sicherzustellen, dass alle Proben gut vermischt sind, dann spin-down kurz Volumenverlust zu verhindern.

(4) RT-Lampe-Assay

1. Pipettieren 23,0 µL RT-Lampe master-Mix pro Reaktion in ein 200 µL PCR-Röhrchen. Fügen Sie 2.0 µL der Probe (Urin, Serum oder grobe Moskito lysate überstand wie in Schritt2 beschrieben hinzu). Dies bringt das Gesamtvolumen zu 25,0 µL pro RT-LAMP-Reaktion. Verwenden Sie für die negativ-Kontrolle Molekulare Grade Wasser. Gehören Sie einer positiven Kontrolle.
   Hinweis: Eine PCR Standard oder Virus-Aktien aus überstand der infizierten Zelle Linien können als Positivkontrolle verwendet werden.
   1. Optional: Sind ein Besonderheit Kontrollreaktion von einem verwandten Arboviren wie Dengue-Fieber-Virus (DENV). Bereiten Sie die Probe, wie in Schritt2 beschrieben, je nach Probentyp. 23.0 µL RT-Lampe master-Mix in ein 200 µL PCR Rohr 2.0 µL des Spezifität Steuerelements hinzufügen.
2. Erwärmen Sie die Proben bei 61 ° C für 30 min mit einem Heizblock, Wasserbad oder Thermocycler.
3. Hitze ausschalten die Polymerase durch Erhitzen auf 80 ° C für 10 Minuten.

(5) RT-Lampe Analyse

Hinweis: Führen Sie RT-Lampe Analyse in einem separaten, abgeschlossenen Raum.

1. Zugreifen Sie nach der Inkubation RT-Lampe Reaktionen visuell durch das Vorhandensein einer Farbänderung suchen.
   1. Verdünnen Sie die fluoreszierende Nukleinsäure-Farbstoff 01:10 in TAE (40 mM Tris, Essigsäure 20 mM, 1 mM EDTA)-Puffer.
      Achtung: Nukleinsäure-Fleck bindet an Nukleinsäuren und ist daher ein Karzinogen. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit.
   2. Fügen Sie 12 µL RT-LAMP-Reaktion hinzu 2 µL der fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoff Verdünnung.
      Hinweis: Negative Reaktionen werden Orange Farbe und positive Reaktionen werden gelb/grün in der Farbe.
   3. Optional: Machen Sie Fotos von RT-Lampe Reaktionen auf weißem Hintergrund mit einer Kamera.
2. Legen Sie die Proben unter 302 nm UV-Licht, das Vorhandensein von RT-Lampe Produkte durch Fluoreszenz zu bestätigen. Fotografieren Sie das Ergebnis mit Hilfe einer Kamera.
   Hinweis: Positive RT-Lampe Reaktionen werden einen fluoreszierenden Ausgang haben.
   Achtung: Tragen Sie UV schützende Auge Googles oder Gesicht Schild mit UV-Licht arbeiten.
3. Optional: Bestätigen Sie das Vorhandensein von RT-Lampe Produkte durch Gelelektrophorese auf den Proben durchführen.
   1. Gießen Sie eine 2 % Agarose-Gel in 1 X TAE-Puffer mit einer Nukleinsäure-beize für die Visualisierung.
      Achtung: Nukleinsäure-Fleck bindet an Nukleinsäuren und ist daher ein Karzinogen. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit.
   2. Fügen Sie 5 µL einer DNA-Leiter in der ersten Spur, die Molmassen zu vergleichen.
   3. Mischen Sie für jede Reaktion RT-Lampe 13 µL RT-Lampe Reaktionsmischung mit 2 µL DNA loading Dye. Laden Sie die 15 µL Gemisch mit der DNA Farbstoff beladen.
   4. Führen Sie das Gel bei 90 V für 90 Minuten oder bis die Bänder getrennt sind und Bild mit 302 nm UV-Licht.
      Hinweis: Positive RT-Lampe Reaktionen werden eine laddering Muster haben. Negative Reaktionen der RT-Lampe sollte keine Bands enthalten.

6. Entsorgung

1. RT-Lampe Reaktionen in doppelt versiegelte Beutel entsorgen. Tun Sie nicht Autoklaven, wie dies die RT-Lampe Produkte, was zu falsch positiven Reaktionen in der Zukunft aerosolisieren kann.

Ergebnisse

RT-Lampe Reaktionen können mit drei verschiedenen Methoden analysiert werden. Zunächst mit dem Zusatz eines fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoffs werden positive Reaktionen gelb/grün in der Farbe negative Reaktionen erscheinen wo Orange in der Farbe mit dem bloßen Auge. Zweitens führt die Zugabe von fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoff, RT-LAMP-Reaktion ein Fluoreszenzsignal wenn die Proben mit UV-Licht angeregt werden. Negative Reaktionen haben keinen nachweisbaren Fluoresze...

Diskussion

Die ZIKV RT-Lampe-Assay in diesem Papierarbeiten mit Menschen- und Moskito Proben⁶beschrieben. Der Nachweisgrenze wurde ca. 1 Genom entspricht⁶, was ausreichen sollte, da die typische Viruslast eines symptomatischen ZIKV infizierten Patienten 10³ bis 10⁶ PFU/mL⁷. Darüber hinaus kann diese Methode ZIKV in Proben ohne erste isolierende RNA und ohne Verstärkung der Virus in der Zellkultur erkennen. Dies verringert deu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A