Invertire l'amplificazione isotermica mediata da Loop-trascrizione (RT-LAMP) analisi per Virus di Zika e geni Housekeeping in urina, siero ed esempi di zanzara

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e a basso costo per rilevare virus di Zika o controllare obiettivi in campioni di urina e del siero umano o nelle zanzare di amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP). Questo metodo non richiede isolamento del RNA e può essere fatto entro 30 min.

Abstract

L'infezione con il virus di Zika (ZIKV) può essere asintomatico negli adulti, tuttavia, l'infezione durante la gravidanza può portare a aborto spontaneo e difetti di nascita neurologici severi. L'obiettivo del presente protocollo è quello di rilevare rapidamente ZIKV nei campioni umani e di zanzara. Il gold standard attuale per il rilevamento di ZIKV è quantitativa trascrizione d'inversione PCR (qRT-PCR); amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP) può consentire per un test più efficiente e a basso costo senza la necessità di costose attrezzature. In questo studio, RT-LAMP è utilizzato per il rilevamento di ZIKV in vari campioni biologici entro 30 min, senza prima isolare il RNA dal campione. Questa tecnica è dimostrata utilizzando ZIKV infettato il paziente urina e del siero e infettati campioni di zanzara. Acido ribonucleico ribosomiale 18s e actina sono utilizzati come controlli in campioni umani e zanzara, rispettivamente.

Introduzione

Nel 2015, virus di Zika (ZIKV) guadagnato l'attenzione globale prominente come una malattia infettiva di preoccupazione perché l'infezione durante la gravidanza è stato collegato a aborto spontaneo, morte endouterina, gravi difetti di nascita neurologici compreso microcefalia, come pure altri congenita difetti di nascita¹. In rari casi, ZIKV è stato associato con la sindrome di Guillain-Barré. ZIKV principalmente è trasmessa dalle zanzare Aedes ; Tuttavia, può anche essere sparso attraverso il contatto sessuale¹. Dato che l'infezione con ZIKV è asintomatica nella maggior parte delle persone o presenta con lievi sintomi simil-influenzali che si sovrappongono con i sintomi di infezione di altri arborviruses¹, ci era un'esigenza di miglioramento dei metodi per la rilevazione rapida e conveniente di ZIKV a schermo persone nonché a popolazioni di zanzare locali.

Trascrizione d'inversione quantitativa PCR (qRT-PCR) è un test affidabile per la determinazione di ZIKV; Tuttavia, questa tecnica richiede costose attrezzature specializzate, personale addestrato e l'isolamento di RNA dal campione di interesse. Amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP) è un metodo di amplificazione dell'acido nucleico di One-Step basato su tecnologia PCR che richiede solo una temperatura di incubazione dovute all'uso di una DNA polimerasi termofila con filo Proprietà di scostamento. Questo aggira la necessità per un termociclatore e diminuisce la lunghezza del tempo necessario per completare il test. Ulteriori vantaggi del RT-LAMP includono la sua alta specificità e sensibilità, robustezza ad una gamma di temperature e livelli di pH, di resistenza a molti di inibitori della PCR². Ha un costo relativamente basso e i reagenti sono stabili a temperatura ambiente. Date queste caratteristiche, RT-LAMP può essere distribuito in un laboratorio o sul campo. Come tale, reazioni di lampada sono state sviluppate per rilevare una gamma di agenti patogeni e altri tipi di infezione^3,4,5. L'obiettivo del protocollo RT-LAMP descritto in questa carta è di rilevare ZIKV senza isolamento del RNA in umani campioni di siero e urina come pure come in una singola zanzara infetta entro 30 min attraverso RT-LAMP. Questo metodo può essere utilizzato per sostituire qRT-PCR, in quanto è uno strumento diagnostico rapido, sensibile che funziona rapidamente e in contesti di fuori del laboratorio.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da istituzionale Review Board (IRB) della salute di Beaumont. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente alle norme e linee guida pertinenti.

Attenzione: Tutti i materiali potenzialmente infettivi devono essere manipolati secondo gli standard di livello 2 di biosicurezza compreso l'uso di dispositivi di protezione individuale. Eventuali procedure che possono produrre aerosol devono essere eseguite in una cappa di biosicurezza. Inoltre, il lavoro con le zanzare dal vivo deve essere svolto in apposito impianto di artropodi contenimento livello 1-3. Dato l'associazione dell'infezione di ZIKV con le anomalie congenite, donne che sono incinte, provando a concepire, o i partner di queste donne dovrebbero minimizzare significativamente la loro esposizione di laboratorio a ZIKV. Trasporto dei campioni ZIKV è classificato negli Stati Uniti come categoria B sostanze biologiche secondo normative dipartimento del trasporto pericolosi materiali (49 CFR parte 171-180) e pertanto i campioni di trasporto dovrebbero aderire a quelli linee guida. Importazione negli Stati Uniti di ZIKV biospecimens richiede un centri per controllo delle malattie e prevenzione (CDC) permesso di importazione. Importazione di qualsiasi artropodi che potrebbe servire come un vettore per la trasmissione ZIKV, anche se non sono infetti, richiede un permesso di United States Department of Agriculture (USDA). Queste informazioni sono aggiornate al momento della pubblicazione. Consigli sono aggiornati possono essere trovati alla https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

Nota: Reazioni di RT-LAMP sono soggette a tassi più elevati di reazioni falsamente positive, quindi bisogna tener conto nella pianificazione sperimentale. Tutti i set-up e l'esecuzione delle reazioni di RT-LAMP dovrebbe utilizzare designati pipette e puntali con filtro. Idealmente, si dovrebbe istituire un flusso di lavoro laterale. Se possibile, analisi e imaging (sezione 5) dovrebbe verificarsi in una stanza chiusa separata per evitare la contaminazione. Apertura di provette contenenti prodotti di RT-LAMP dovrebbe essere ridotto al minimo.

1. RT-LAMP Primer preparazione

1. Ricostituire ogni primer RT-LAMP liofilizzato in acqua di grado molecolare a una concentrazione finale di 100 µM (tabella 1). Brevemente vortex la soluzione di primer per garantire una soluzione omogenea e brevemente rotazione verso il basso la soluzione in una centrifuga di piano d'appoggio per raccogliere tutta la soluzione di primer alla massima velocità.
2. Preparare un 10 x RT-LAMP Primer Mix dei primer FIP, BIP, F3, B3, LF e LB utilizzando i volumi nella tabella 2. Brevemente vortex la soluzione di primer per garantire una soluzione omogenea e brevemente rotazione verso il basso la soluzione in una centrifuga di piano d'appoggio per evitare qualsiasi perdita alla massima velocità.
   Nota: Il primer RT-LAMP per Ae. aegypti actina (AEDAE) non contiene un primer LB (ciclo primer non sono sempre necessari per reazioni di RT-LAMP). In questo caso, sostituire il volume di primer LB con acqua grado molecolare.
3. Conservare i primer a-20 ° C tra un utilizzo ed evitare cicli di scongelamento gratis.

2. preparazione del campione

1. Per i campioni di urina umana: Utilizzare l'urina fresca, congelata urina o urina in conservante. Per esempio fresco o congelato: immediatamente girare giù il campione dopo la raccolta per 10 min a 700 x ge utilizzare il surnatante per analisi o congelare a-80 ° C per un uso futuro. Scongelare i campioni congelati sul ghiaccio prima dell'uso.
2. Per campioni di siero umano: Utilizzare entrambi i campioni di siero fresco o congelato.
3. Per ZIKV infettato linee cellulari: utilizzare media condizionati o lisati cellulari.
   Nota: Cell-free condizionata media da Ae. Albopictus C6/36 celle 8 giorni dopo l'infezione può essere utilizzato come controlli positivi per le reazioni ZIKV RT-LAMP.
4. Per le zanzare Ae. aegypti : utilizzare o carcasse di zanzara intero fresco o congelato. Scongelare i surgelati zanzare sul ghiaccio. Preparare una zanzara greggia lisata inserendo una zanzara individuo in 100 µ l di tampone fosfato salino (PBS) e omogeneizzare schiacciando la zanzara 10 volte con una punta di pipetta P10 (Figura 1). Centrifugare brevemente il greggio lisato a pellet eventuali detriti. Utilizzare il surnatante per analisi di RT-LAMP a valle.
   Nota: Controlli positivi possono essere generati in un ambiente di laboratorio infettando le zanzare femmina mediante microiniezione intratoracica con circa 10³ equivalenti di genoma del virus in un volume di 200 nL e raccolta la zanzara 5 giorni dopo l'infezione.

3. preparare la miscela di RT-lampada Master

1. Preparare una reazione di mix master RT-LAMP sul ghiaccio per ciascun primer impostato per essere utilizzato tramite Guida volume in tabella 3.
   Nota: L'uso di termolabile uracile DNA glicosilasi (UDG) aiuta a prevenire falsi positivi.
2. Vortice brevemente per garantire che tutti i campioni sono ben miscelati, quindi rallentare brevemente per prevenire la perdita di volume.

4. RT-LAMP test

1. Dispensare 23.0 µ l di master mix RT-LAMP per reazione in una provetta PCR 200 µ l. Aggiungere 2,0 µ l di campione (urina, siero o il surnatante lisato zanzara grezza come descritto nel passaggio 2). Questo porterà il volume totale a 25,0 µ l per reazione di RT-LAMP. Per il controllo negativo, usare acqua di grado molecolare. Includere un controllo positivo.
   Nota: Un scorte PCR standard o virus da supernatante di linee cellulari infettate possono essere utilizzato come controllo positivo.
   1. Opzionale: Includono una reazione di controllo di specificità di un arbovirus correlate quali virus dengue (DENV). Preparare il campione come descritto nel passaggio 2 in base al tipo di campione. Aggiungere 2,0 µ l del controllo specificità a 23.0 µ l di master mix RT-LAMP in una provetta PCR 200 µ l.
2. Riscaldare i campioni a 61 ° C per 30 min utilizzando un blocco di calore, bagno d'acqua o termociclatore.
3. Calore per disattivare la polimerasi riscaldamento a 80 ° C per 10 min.

5. RT-LAMP analisi

Nota: Eseguire analisi di RT-LAMP in uno spazio separato, chiuso.

1. Dopo l'incubazione, accedere visivamente reazioni di RT-LAMP ricercando la presenza di un cambiamento di colore.
   1. Diluire l'acido nucleico fluorescente tintura 01:10 in tampone TAE (40 mM Tris, acido acetico 20 mM, 1 mM EDTA).
      Attenzione: Qualsiasi macchia di acido nucleico si lega agli acidi nucleici e quindi è un agente cancerogeno. Indossare guanti durante la manipolazione.
   2. 12 µ l del RT-LAMP, aggiungere 2 µ l di diluizione della tintura fluorescente dell'acido nucleico.
      Nota: Reazioni Negative sarà colore arancione e reazioni positive sarà di colore giallo/verde.
   3. Optional: Scattare foto di reazioni di RT-LAMP su sfondo bianco, usando una macchina fotografica.
2. Posizionare i campioni sotto 302 nm UV luce per confermare la presenza di prodotti di RT-LAMP di fluorescenza. Scattare foto del risultato usando una macchina fotografica.
   Nota: Le reazioni Positive RT-LAMP avrà un output fluorescente.
   Attenzione: Indossare UV occhio protettivo googles o faccia scudo quando si lavora con luce UV.
3. Optional: Confermare la presenza di prodotti di RT-LAMP eseguendo l'elettroforesi del gel sui campioni.
   1. Versare un gel di agarosio al 2% in 1 x TAE buffer con una macchia di acido nucleico per la visualizzazione.
      Attenzione: Qualsiasi macchia di acido nucleico si lega agli acidi nucleici e quindi è un agente cancerogeno. Indossare guanti durante la manipolazione.
   2. Aggiungere 5 µ l di una scala di DNA nella corsia prima di confrontare i pesi molecolari.
   3. Per ogni reazione di RT-LAMP, mescolare 13 µ l di miscela di reazione di RT-LAMP con 2 µ l di DNA della tintura di caricamento. Caricare la miscela di 15 µ l che contiene il DNA della tintura di caricamento.
   4. Eseguire il gel a 90 V per 90 min o fino a quando le bande sono separate e immagine con 302 nm di luce UV.
      Nota: Le reazioni Positive RT-LAMP avrà un modello laddering. Reazioni negative RT-LAMP non devono contenere qualsiasi bande.

6. smaltimento

1. Smaltire le reazioni di RT-LAMP in sacchetti sigillati doppi. Non autoclavare come questo può vaporizzerai i prodotti di RT-LAMP, che portano a reazioni falsamente positive in futuro.

Risultati

Reazioni di RT-lampada possono essere analizzate utilizzando tre metodi diversi. In primo luogo, con l'aggiunta di un colorante fluorescente dell'acido nucleico, reazioni positive sarà di colore giallo/verde dove reazioni negative apparirà arancione colore ad occhio nudo. In secondo luogo, l'aggiunta di coloranti fluorescenti dell'acido nucleico per reazione di RT-LAMP genera un segnale fluorescente quando i campioni sono eccitati da luce UV. Reazioni negative non avrà un segnale fluor...

Discussione

Il dosaggio di ZIKV RT-LAMP descritto in questa carta funziona utilizzando sia umani e zanzara campioni⁶. Il limite di rilevazione era circa 1 genoma equivalente⁶, che dovrebbe essere sufficiente, poiché il carico virale tipico di un paziente sintomatico ZIKV infettata è 10³ a PFU/mL 10^{6 7}. Inoltre, questo metodo può rilevare ZIKV nei campioni senza primo isolamento di RNA e senza amplificazione di virus in coltur...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A