Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina

Resumen

Este protocolo proporciona un método eficiente y de bajo costo para detectar virus Zika o controlar objetivos en muestras de suero y orina humanas o en mosquitos por amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa (RT-LAMP). Este método no requiere aislamiento de RNA y se puede hacer dentro de 30 minutos.

Resumen

Infección con el virus Zika (ZIKV) puede ser asintomática en adultos, sin embargo, la infección durante el embarazo puede causar aborto espontáneo y defectos congénitos neurológicos graves. El objetivo de este protocolo es detectar rápidamente ZIKV en muestras de humanos y mosquito. El actual estándar de oro para la detección de ZIKV es cuantitativa transcripción reversa PCR (qRT-PCR); amplificación isotérmica mediada lazo de transcripción inversa (RT-LAMP) puede permitir una prueba más eficiente y de bajo costo sin necesidad de equipo costoso. En este estudio, RT-lámpara se utiliza para la detección de ZIKV en diversas muestras biológicas dentro de 30 minutos, sin primero aislar el RNA de la muestra. Esta técnica se demostró usando ZIKV infectados en suero y orina de pacientes e infectados muestras de mosquitos. Ácido ribonucleico ribosomal de 18S y actina se utilizan como controles en muestras de humanos y mosquito, respectivamente.

Introducción

En 2015, Zika virus (ZIKV) ganó atención mundial prominente como una enfermedad infecciosa de preocupación porque la infección durante el embarazo era ligada a aborto espontáneo, mortinato, graves defectos congénitos neurológicos incluyendo microcefalia, así como otros congénita defectos de nacimiento¹. En casos raros, ZIKV se ha asociado con el síndrome de Guillain-Barré. ZIKV es principalmente transmitida por los mosquitos Aedes ; sin embargo, también se puede propagar a través del contacto sexual¹. Dado que la infección con ZIKV es asintomática en la mayoría de la gente o presenta con suaves gripe-como síntomas que se solapan con los síntomas de la infección de otros arborviruses¹, hubo una necesidad de mejorar los métodos para la detección rápida y rentable de ZIKV para personas, así como las poblaciones de mosquitos locales.

Cuantitativa transcripción reversa PCR (qRT-PCR) es un ensayo confiable para ZIKV; sin embargo, esta técnica requiere costosos equipos especializados, personal capacitado y aislamiento de RNA de la muestra de interés. Amplificación isotérmica loop-mediated de reversa de la transcripción (RT-LAMP) es un método de amplificación de ácido nucleico un solo paso basado en la tecnología PCR que sólo requiere una temperatura de incubación debido al uso de una polimerasa de la DNA termófila con filamento características de la dislocación. Esto evita la necesidad de un termociclador y disminuye la cantidad de tiempo necesario para completar el ensayo. Ventajas adicionales de RT-LAMP incluyen su alta especificidad y sensibilidad, robustez en una gama de niveles de pH y temperatura y resistencia a muchos de los inhibidores de la PCR². Tiene un costo relativamente bajo y los reactivos son estables a temperatura ambiente. Dadas estas características, lámpara de RT se puede implementar en un laboratorio o en el campo. Así, las reacciones de la lámpara se han desarrollado para detectar una gama de agentes patógenos y otros tipos de infección^3,4,5. El protocolo de RT-LAMP descrito en este documento pretende detectar ZIKV sin aislamiento de RNA en suero y orina muestras humanas así como en un solo mosquito infectado dentro de 30 minutos a través de RT-LAMP. Este método puede utilizarse para reemplazar la qRT-PCR es una herramienta de diagnóstico sensible y rápida que funciona rápidamente y en ambientes fuera del laboratorio.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Junta de revisión institucional (IRB) de salud de Beaumont. Todos los experimentos fueron realizados con arreglo a las normas y directrices pertinentes.

PRECAUCIÓN: Todos los materiales potencialmente infecciosos deben ser manipulados según las normas de bioseguridad nivel 2 incluyendo el uso de equipo de protección personal. Todos los procedimientos que pueden producir aerosoles deben realizarse en un gabinete de bioseguridad. Además, trabajo con mosquitos vivos debe realizarse en los centros de artrópodos contención nivel 1-3. Dado la Asociación de infección por ZIKV con anormalidades congénitas, las mujeres que estén embarazadas, intentando concebir, o los socios de estas mujeres deben minimizar significativamente su exposición del laboratorio a ZIKV. Transporte de muestras ZIKV se clasifica en los Estados Unidos como sustancias biológicas de categoría B según departamento de peligrosos materiales regulaciones del transporte (49 CFR parte 171-180) y por lo tanto, envío de muestras debe adherirse a los directrices. Importación en los Estados Unidos de ZIKV biológicas requiere un centros para el Control y prevención de enfermedades (CDC) permiso de importación. Importación de cualquier artrópodos que podría servir como un vector para la transmisión de ZIKV, incluso si no están infectados, requiere un permiso del Departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA). Esta información está actualizada en el momento de publicación. Recomendaciones actualizadas pueden encontrarse en https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

Nota: Las reacciones de RT-LAMP son propensas a mayores tasas de reacciones falsas positivas, por lo que se debe tener cuidado en la planificación experimental. Toda puesta en marcha y ejecución de las reacciones de RT-LAMP deben usar pipetas designados y extremidades de filtro. Idealmente, se debe establecer un flujo de trabajo lateral. Si es posible, análisis y proyección de imagen (sección 5) deben ocurrir en una sala cerrada para prevenir la contaminación. Apertura de tubos de ensayo que contengan productos de RT-LAMP debe mantenerse al mínimo.

1. RT-LAMP Primer preparación

1. Reconstituir cada primer RT-LAMP liofilizado en agua grado molecular a una concentración final de 100 μm (tabla 1). Vortex brevemente la solución de imprimación para garantizar una solución homogénea y girar brevemente por la solución a la máxima velocidad en una centrífuga de mesa para recoger toda la solución la cartilla.
2. Preparar un 10 x RT-LAMP Primer Mix de los iniciadores de la FIP, BIP, F3, B3, LF y LB con los volúmenes en la tabla 2. Vortex brevemente la solución de imprimación para garantizar una solución homogénea y girar brevemente por la solución a la máxima velocidad en una centrífuga de mesa para evitar cualquier pérdida.
   Nota: El primer RT-LAMP para Ae. aegypti actinia (AEDAE) no contiene una cartilla LB (cartillas de lazo no son siempre necesarios para las reacciones de RT-LAMP). En este caso, vuelva a colocar el volumen de la cartilla LB con agua grado molecular.
3. Almacenar los cebadores a-20 ° C entre usos y evitar ciclos de descongelación libre.

2. preparación de la muestra

1. Para las muestras de orina humana: Usar orina fresca, congelada orina u orina en conservante. Para la muestra fresca o congelada: inmediatamente girar por la muestra después de la recolección durante 10 min a 700 x gy utilizar el sobrenadante para el análisis o congelar a-80 ° C para su uso futuro. Descongelar las muestras congeladas en el hielo antes de usarlo.
2. Para muestras de suero humano: Utilice cualquiera de los dos sueros frescos o congelados.
3. Por ZIKV infectados líneas celulares: utilizar medios condicionados o lysates de la célula.
   Nota: Sin células acondicionado media de Ae. albopictus C6/36 células 8 días post-infección puede utilizarse como controles positivos para reacciones ZIKV RT-LAMP.
4. Para los mosquitos Ae. aegypti : utilizar cualquiera de los dos cadáveres de mosquitos entero fresco o congelado. Descongelar los mosquitos congelados en el hielo. Prepare un mosquito crudo lisado colocando un mosquito individual en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y homogeneizar por aplastamiento el mosquito 10 veces con una punta de pipeta P10 (figura 1). Centrifugar brevemente el lisado para que sedimenten los residuos del crudo. Usar el sobrenadante para el análisis de RT-LAMP aguas abajo.
   Nota: Controles positivos pueden generarse en un entorno de laboratorio por infectar a los mosquitos hembras mediante microinyección intratorácica con aproximadamente 10³ equivalentes de genoma del virus en un volumen de 200 nL y cosecha el mosquito 5 días infección posterior.

3. prepare la mezcla maestra RT-LAMP

1. Preparar una reacción de RT-LAMP mix master en hielo para cada cartilla a utilizar por medio de guía de volumen en la tabla 3.
   Nota: El uso de termolábiles Uracil ADN glicosilasa (UDG) ayuda a prevenir falsos positivos.
2. Vortex brevemente para asegurar que todas las muestras estén bien mezcladas, luego girar por brevemente para evitar la pérdida de volumen.

4. RT-LAMP ensayo

1. Pipeta 23,0 μL de la mezcla principal de RT-LAMP por reacción en un tubo PCR de 200 μl. Añada 2.0 μL de muestra (orina, suero o sobrenadante lisado crudo mosquitos como se describe en el paso 2). Esto traerá el volumen total a 25.0 μL por reacción de RT-LAMP. Para el control negativo, use agua de grado molecular. Incluir un control positivo.
   Nota: Una polimerización en cadena estándar o el virus de las poblaciones de sobrenadante de células infectadas pueden ser utilizado como control positivo.
   1. Opcional: Incluyen una reacción de control de la especificidad de un arbovirus relacionados como el virus del dengue (DENV). Preparar la muestra como se indica en el paso 2 según tipo de muestra. Añada 2.0 μL del control especificidad a 23.0 μL de la mezcla principal de RT-LAMP en un tubo PCR de 200 μl.
2. Calentar las muestras a 61 ° C por 30 min con un bloque de calor, baño de agua o termociclador.
3. Calor desactiva la polimerasa por calentamiento a 80 ° C durante 10 minutos.

5. RT-LAMP análisis

Nota: Realizar el análisis de RT-LAMP en un espacio independiente, cerrado.

1. Después de la incubación, para acceder a las reacciones de RT-LAMP visualmente en busca de la presencia de un cambio de color.
   1. Diluir el ácido nucleico fluorescente tinte 1:10 en Tampón TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM, 1 mM EDTA).
      PRECAUCIÓN: Cualquier mancha de ácido nucleico se une a los ácidos nucleicos y por lo tanto es un agente carcinógeno. Use guantes cuando maneje.
   2. A 12 μl de la reacción de RT-LAMP, añadir 2 μl de dilución de colorante fluorescente de ácidos nucleicos.
      Nota: Las reacciones negativas es color anaranjado y reacciones positivas será amarillo-verde en color.
   3. Opcional: Tomar fotos de las reacciones de RT-lámpara sobre un fondo blanco con una cámara.
2. Coloque las muestras en 302 nm UV luz para confirmar la presencia de productos de RT-lámpara de fluorescencia. Tomar fotografía del resultado del uso de una cámara.
   Nota: Las reacciones de RT-LAMP positivo tendrá una salida fluorescente.
   PRECAUCIÓN: Use protector de cara o gafas de protección ocular UV cuando se trabaja con luz UV.
3. Opcional: Confirmar la presencia de productos de RT-LAMP al realizar la electroforesis en gel de las muestras.
   1. Vierta un gel de agarosa al 2% en 1 buffer de x TAE con una mancha de ácido nucleico para la visualización.
      PRECAUCIÓN: Cualquier mancha de ácido nucleico se une a los ácidos nucleicos y por lo tanto es un agente carcinógeno. Use guantes cuando maneje.
   2. Añadir 5 μl de una escalera de DNA en el primer carril para comparar los pesos moleculares.
   3. Para cada reacción de RT-LAMP, mezcla 13 μl de mezcla de reacción RT-LAMP con 2 μl de ADN carga del tinte. Carga de la mezcla de 15 μl que contiene el ADN carga del tinte.
   4. Correr el gel en 90 V durante 90 minutos o hasta que las bandas se separan y la imagen con la luz de UV de 302 nm.
      Nota: Las reacciones de RT-LAMP positiva tendrá un patrón escalonado. Las reacciones de RT-LAMP negativas no deben contener cualquier bandas.

6. eliminación de desechos

1. Deshacerse de las reacciones de RT-LAMP en doble bolsas selladas. No autoclave como esto puede transformar los productos de RT-LAMP, conduciendo a falsas reacciones positivas en el futuro.

Resultados

Las reacciones de RT-LAMP pueden analizarse utilizando tres métodos diferentes. En primer lugar, con la adición de un colorante fluorescente de ácidos nucleicos, reacciones positivas será color amarillo/verde que reacciones negativas aparece naranja en color a simple vista. En segundo lugar, la adición de colorante fluorescente de ácidos nucleicos a la reacción de RT-lámpara produce una señal fluorescente cuando las muestras son excitadas por la luz UV. Las reacciones negativas n...

Discusión

El ensayo de ZIKV RT-LAMP descrito en este papel los trabajos utilizando muestras de humanos y mosquitos⁶. El límite de detección fue de aproximadamente 1 genoma equivalente⁶, que debería ser suficiente ya que la carga viral típica de un paciente sintomático ZIKV infectado es de 10³  PFU/mL⁶ 10⁷. Además, este método puede detectar ZIKV en muestras sin primer RNA aislamiento y sin amplificación del virus en cu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A