Essais de Transcription-boucle-négociée l’Amplification isotherme (RT-lampe) pour Virus Zika et gènes domestiques dans l’Urine, sérum et des échantillons de moustiques réverse

Résumé

Ce protocole fournit une méthode efficace et peu coûteux pour détecter le virus Zika ou contrôler des cibles dans des échantillons d’urine et le sérum humains ou chez les moustiques par amplification isotherme boucle-négociée de transcription inverse (RT-lampe). Cette méthode ne nécessite pas d’ARN et peut se faire dans les 30 minutes.

Résumé

Infection par le virus Zika (ZIKV) peut être asymptomatique chez l’adulte, cependant, infection pendant la grossesse peut entraîner une fausse couche et de graves malformations neurologiques. Ce protocole vise à détecter rapidement les ZIKV dans des échantillons humains et de moustiques. L’étalon-or actuel pour la détection de ZIKV est la transcription inverse quantitative PCR (qRT-PCR) ; l’amplification isotherme boucle-négociée la transcription inverse (RT-lampe) peut permettre un test plus efficace et à moindre coût sans besoin de matériel coûteux. Dans cette étude, RT-lampe est utilisée pour la détection de ZIKV dans divers échantillons biologiques dans les 30 minutes, sans premier isoler l’ARN de l’échantillon. Cette technique est démontrée en utilisant ZIKV infectés par le sérum et l’urine de patients et infecté des échantillons de moustiques. L’acide ribonucléique ribosomique 18 s et l’actine sont utilisés comme témoins dans des échantillons humains et moustique, respectivement.

Introduction

En 2015, Zika virus (ZIKV) attiré l’attention mondiale éminente comme une maladie infectieuse des préoccupations parce que l’infection pendant la grossesse était liée à la fausse couche, de mortinatalité, de graves neurologiques congénitales incluant une microcéphalie, ainsi qu’autres congénitale ¹de malformations congénitales. Dans de rares cas, ZIKV a été associée avec le syndrome de Guillain-Barré. ZIKV est principalement transmis par les moustiques du genre Aedes ; Toutefois, il peut également se propager par contact sexuel¹. Étant donné que l’infection avec ZIKV est asymptomatique chez la plupart des gens ou présente avec grippe-comme des symptômes bénins qui se chevauchent avec les symptômes de l’infection à d’autres arborviruses¹, il y avait un besoin d’amélioration des méthodes de détection rapide et rentable de ZIKV pour dépister les personnes ainsi que les populations de moustiques locaux.

La transcription inverse quantitative PCR (qRT-PCR) est une méthode fiable pour la détection de ZIKV ; Cependant, cette technique nécessite de coûteux équipements spécialisés, un personnel formé et isolement d’ARN de l’échantillon d’intérêt. L’amplification isotherme boucle-négociée la transcription inverse (RT-lampe) est un procédé d’amplification d’acide nucléique one-step basé sur la technologie PCR qui exige seulement une température d’incubation en raison de l’utilisation d’une ADN polymérase thermophile avec fil Propriétés de déplacement. Cela contourne la nécessité d’un thermocycleur et diminue la longueur du temps nécessaire pour effectuer le test. Avantages supplémentaires de RT-lampe incluent sa grande spécificité et la sensibilité, la robustesse à un éventail de niveaux de pH et températures et résistance aux nombreux PCR inhibiteurs². Il a un coût relativement faible et les réactifs sont stables à température ambiante. Compte tenu de ces caractéristiques, RT-lampe peut être déployé dans un laboratoire ou sur le terrain. À ce titre, les réactions de lampe ont été développées pour détecter un éventail d’agents pathogènes et d’autres types d’infection^3,4,5. L’objectif du protocole RT-lampe décrit dans le présent document est de détecter les ZIKV sans isolement d’ARN dans les échantillons de sérum et l’urine humaines ainsi que dans un seul moustique infecté dans les 30 minutes par l’intermédiaire de RT-lampe. Cette méthode peut être utilisée pour remplacer qRT-PCR car c’est un outil de diagnostic sensible et rapid qui fonctionne rapidement et dans des cadres à l’extérieur du laboratoire.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) de la santé de Beaumont. Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes.

ATTENTION : Tous les matériels potentiellement infectieux doivent être manipulés selon les normes de niveau de biosécurité 2 y compris l’utilisation des équipements de protection individuelle. Des procédures qui peuvent produire des aérosols doivent être effectuées dans une armoire de sécurité biologique. En outre, les travaux avec les moustiques vivants doivent être effectués dans la communité arthropode niveau de confinement 1-3. Compte tenu de l’association de l’infection à ZIKV avec les anomalies congénitales, femmes enceintes, essaient de concevoir, ou les partenaires de ces femmes devraient considérablement minimiser leur exposition en laboratoire à ZIKV. Transport des échantillons ZIKV est classée catégorie B Substances biologiques conformément au ministère des transports matières dangereuses aux États-Unis (49 CFR, partie 171-180) et par conséquent d’expédition des échantillons devrait adhérer à ceux lignes directrices. Importation dans les échantillons biologiques aux États-Unis de ZIKV nécessite un centres pour Disease Control and Prevention (CDC) permis d’importation. Importation de n’importe quel arthropodes qui pourrait être utilisé comme un vecteur de transmission de ZIKV, même si elles ne sont pas infectés, exige un permis de l’United States Department of Agriculture (USDA). Cette information est à jour au moment de la publication. Recommandations à jour peuvent être trouvées à https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

Remarque : Les réactions de RT-lampe sont sujettes à des taux plus élevés de fausses réactions positives, donc les précautions doivent être prises dans la planification expérimentale. Tous les set-up et l’exécution des réactions RT-lampe doivent utiliser des pipettes désignés et bouts filtrants. Idéalement, il faudrait un flux de travail latéral. Si possible, l’analyse et imagerie (Section 5) devraient avoir lieu dans une salle séparée et fermée pour éviter la contamination. Ouverture des tubes à essai contenant des produits RT-lampe doit être maintenue à un minimum.

1. préparation d’amorce RT-lampe

1. Reconstituer chaque amorce RT-lampe lyophilisée dans l’eau de qualité moléculaire à une concentration finale de 100 µM (tableau 1). Vortex brièvement la solution d’apprêt pour assurer une solution homogène et tourner brièvement vers le bas de la solution à la vitesse maximale dans une centrifugeuse de dessus de table pour recueillir toutes les solution d’apprêt.
2. Préparer un 10 x RT-lampe Primer Mix des amorces FIP, BIP, F3, B3, LF et LB en utilisant les volumes dans le tableau 2. Vortex brièvement la solution d’apprêt pour assurer une solution homogène et brièvement tourner vers le bas de la solution à la vitesse maximale dans une centrifugeuse de table afin d’éviter toute perte.
   Remarque : L’abécédaire de RT-lampe pour Ae. aegypti actine (AEDAE) ne contient-elle pas une amorce LB (amorces de boucle ne sont pas toujours nécessaires pour les réactions de RT-lampe). Dans ce cas, remplacer le volume d’amorce LB avec l’eau de qualité moléculaire.
3. Stocker les amorces à-20 ° C entre les utilisations et éviter les cycles libres-décongélation.

2. préparation de l’échantillon

1. Pour les échantillons d’urine humaine : Utiliser les urines fraîches, congelée urine ou urine en agent de conservation. Pour des échantillons frais ou congelés : immédiatement tourner vers le bas de l’échantillon après la collecte pendant 10 min à 700 get utiliser le surnageant pour analyse ou congeler à-80 ° C pour une utilisation future. Décongeler les échantillons congelés sur la glace avant utilisation.
2. Pour les échantillons de sérum humain : Utilisez soit des échantillons de sérum frais ou congelés.
3. Pour ZIKV infectés de lignées cellulaires: utiliser milieux conditionnés ou lysats cellulaires.
   NOTE : Acellulaire conditionné des médias de l’Ae. albopictus C6/36 cellules 8 jours après l’infection peut servir de témoins positifs pour les réactions de ZIKV RT-lampe.
4. Pour les moustiques Ae. aegypti : utiliser deux carcasses de moustique entières fraîches ou congelées. Décongelez les moustiques congelés sur la glace. Préparer un lysat de moustique brut en plaçant un moustique individuel dans 100 µL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et homogénéiser en écrasant le moustique 10 fois avec une pointe de pipette P10 (Figure 1). Brièvement, centrifuger le brut lysat pour granuler les débris. Utilisez le surnageant pour analyse de RT-lampe en aval.
   Remarque : Les témoins positifs peuvent être générés dans un laboratoire en infectant les moustiques femelles à l’aide de microinjection intrathoracique avec environ 10³ génomes de virus dans un volume de 200 nL et récolte le moustique 5 jours après l’infection.

3. préparer le mélange réactionnel RT-lampe

1. Préparer une réaction de mix master RT-feu sur la glace pour chaque amorce à utiliser à l’aide de guide du volume dans le tableau 3.
   Remarque : L’utilisation de thermolabile uracile DNA Glycosylase (UDG) aide à prévenir les faux positifs.
2. Vortex brièvement pour s’assurer que tous les échantillons sont bien mélangés, puis tournez en bas brièvement pour prévenir la perte de volume.

4. RT-lampe test

1. Pipette 23,0 µL du mélange maître RT-lampe par réaction dans un tube PCR de 200 µL. Ajouter 2.0 µL de l’échantillon (urine, sérum ou surnageant lysate brut moustique comme décrit à l’étape 2). Ceci amènera le volume total à 25,0 µL par réaction de RT-lampe. Pour le contrôle négatif, utiliser de l’eau moléculaire de catégorie. Inclure un contrôle positif.
   Remarque : Une PCR standard ou virus les stocks de surnageant de lignées cellulaires infectées peut être utilisé comme témoin positif.
   1. Facultatif : Inclure une réaction de contrôle de spécificité d’un arbovirus connexes tels que les virus de la dengue (DENV). Préparation des échantillons comme indiqué à l’étape 2, selon le type d’échantillon. Ajouter 2.0 µL du contrôle spécificité à 23,0 µL du mélange maître RT-lampe dans un tube PCR de 200 µL.
2. Faire chauffer les échantillons à 61 ° C pendant 30 min à l’aide d’un bloc chauffant, bain-marie ou thermocycleur.
3. Chaleur désactiver la polymérase par chauffage à 80 ° C pendant 10 min.

5. RT-lampe analyse

Remarque : Effectuer une analyse de RT-lampe dans un espace séparé et clos.

1. Après l’incubation, accéder à des réactions de RT-lampe visuellement en recherchant la présence d’un changement de couleur.
   1. Diluer la fluorescence des acides nucléiques colorant 01:10 dans un tampon TAE (40 mM Tris, d’acide acétique 20 mM, EDTA 1 mM).
      ATTENTION : Toute tache acide nucléique se lie aux acides nucléiques et est par conséquent une substance cancérigène. Portez des gants lorsque vous manipulez.
   2. À 12 µL de la réaction de RT-lampe, ajouter 2 µL de dilution de colorant fluorescent des acides nucléiques.
      Remarque : Des réactions négatives seront orange en couleur et des réactions positives seront de couleur jaune/vert.
   3. En option : Prendre des photos des réactions RT-lampe sur un fond blanc à l’aide d’une caméra.
2. Placer les échantillons sous 302 nm UV lumière pour confirmer la présence de produits RT-lampe par fluorescence. Prendre la photo du résultat à l’aide d’une caméra.
   Remarque : Les réactions positives RT-lampe aura une sortie fluorescente.
   ATTENTION : Porter des UV protection oculaire googles ou face bouclier lorsque vous travaillez avec la lumière UV.
3. En option : Confirmer la présence de produits RT-lampe en effectuant l’électrophorèse sur gel sur les échantillons.
   1. Versez un gel d’agarose de 2 % dans un tampon x TAE 1 avec une tache acide nucléique pour la visualisation.
      ATTENTION : Toute tache acide nucléique se lie aux acides nucléiques et est par conséquent une substance cancérigène. Portez des gants lorsque vous manipulez.
   2. Ajouter 5 µL d’une échelle d’ADN dans la première voie pour comparer les poids moléculaires.
   3. Pour chaque réaction de RT-lampe, mélanger 13 µL du mélange réactionnel RT-lampe avec 2 µL d’ADN colorant de chargement. Charger le mélange 15 µL contenant l’ADN colorant de chargement.
   4. Exécutez le gel à 90 V pendant 90 min ou jusqu'à ce que les bandes sont séparées et l’image à 302 nm UV.
      Remarque : Les réactions positives RT-lampe aura un motif approfondi. Des réactions négatives de RT-lampe ne doivent contenir aucune bande.

6. Elimination des déchets

1. Débarrassez-vous des réactions RT-lampe dans un sac scellé double. Ne pas stériliser car cela peut pulvériser les produits de RT-lampe, conduisant à des réactions faussement positives à l’avenir.

Résultats

Réactions de RT-lampe peuvent être analysées à l’aide de trois méthodes différentes. Tout d’abord, avec l’ajout d’un colorant fluorescent des acides nucléiques, des réactions positives sera jaune/vert en couleur où les réactions négatives apparaîtra orange en couleur à le œil nu. En second lieu, l’ajout du colorant fluorescent des acides nucléiques à réaction RT-lampe provoque un signal fluorescent lorsque les échantillons sont excités par la lumière UV. Réa...

Discussion

Le dosage de ZIKV RT-lampe décrit dans cette étude des œuvres à l’aide de fois l’homme et les moustiques échantillons⁶. La limite de détection était environ 1 génome équivalent⁶, qui devrait être suffisant puisque la charge virale typique d’un patient ZIKV infecté symptomatique est 10³ à 10⁶ UFP/mL⁷. En outre, cette méthode peut détecter des ZIKV dans les échantillons sans premier isolement RNA e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A