Reverter a transcrição Loop-mediada por amplificação isotérmica (RT-lâmpada) ensaio para vírus Zika e Housekeeping Genes em amostras de Mosquito, soro e urina

Resumo

Este protocolo fornece um método eficiente e de baixo custo para detectar vírus Zika ou controlar alvos em amostras de urina e soro humanas ou em mosquitos por amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada). Este método não requer isolamento de RNA e pode ser feito dentro de 30 min.

Resumo

Infecção com vírus Zika (ZIKV) pode ser assintomática em adultos, no entanto, a infecção durante a gravidez pode levar a aborto e neurológicos graves defeitos de nascimento. O objetivo do presente protocolo é rapidamente detectar ZIKV em amostras de ambos humanos e mosquito. O atual padrão-ouro para a deteção de ZIKV é quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR); amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada) pode permitir um teste mais eficiente e de baixo custo sem a necessidade de equipamento caro. Neste estudo, RT-lâmpada é utilizada para detecção de ZIKV em diversas amostras biológicas dentro de 30 min, sem primeiro a isolar o RNA da amostra. Esta técnica é demonstrada usando ZIKV infectados, soro e urina de paciente e infectado amostras de mosquito. O ácido ribonucleico ribossomal 18s e actina são usados como controles em amostras de humanos e mosquito, respectivamente.

Introdução

Em 2015, vírus Zika (ZIKV) ganharam atenção mundial proeminente como uma doença infecciosa de preocupação porque infecção durante a gravidez estava ligada ao aborto, morte fetal, graves defeitos congênitos neurológicos incluindo microcefalia, bem como outras doenças congênitas defeitos de nascimento¹. Em casos raros, ZIKV tem sido associado com a síndrome de Guillain-Barré. ZIKV é transmitida principalmente pelo Aedes mosquitos; no entanto, ele também pode ser transmitido através de de contato sexual¹. Dado que a infecção com ZIKV é assintomática na maioria das pessoas ou apresenta com gripe-como sintomas leves que se sobrepõem com os sintomas da infecção de outros arborviruses¹, havia uma necessidade de métodos aperfeiçoados de detecção rápida e econômica de ZIKV para as pessoas, bem como populações locais mosquito da tela.

A transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) é um ensaio confiável para a deteção de ZIKV; no entanto, esta técnica requer equipamento especializado caro, pessoal treinado e isolamento de RNA da amostra de interesse. Transcrição reversa mediada por laço amplificação isotérmica (RT-lâmpada) é um método de amplificação do ácido nucleico de uma etapa baseado na tecnologia PCR que apenas requer uma temperatura de incubação devido ao uso de uma DNA-polimerase termofílicas com vertente Propriedades de deslocamento. Isso evita a necessidade de um thermocycler e diminui o comprimento de tempo necessário para completar o ensaio. Vantagens adicionais da RT-lâmpada incluem sua alta especificidade e sensibilidade, robustez em uma variedade de níveis de pH e temperatura e resistência a muitos inibidores PCR². Tem um custo relativamente baixo e os reagentes são estáveis à temperatura ambiente. Tendo em conta estas características, RT-lâmpada pode ser implantada em um laboratório ou no campo. Como tal, as reações de luz foram desenvolvidas para detectar uma gama de patógenos e outros tipos de infecção^3,4,5. O objetivo do protocolo de RT-lâmpada descrito neste documento é detectar ZIKV sem isolamento de RNA no soro e urina amostras humanas, bem como em um único mosquito infectado dentro de 30 min por meio de RT-lâmpada. Esse método pode ser usado para substituir o qRT-PCR, que é uma ferramenta de diagnóstico sensível e rápida que funciona rapidamente e em configurações fora do laboratório.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB) de saúde de Beaumont. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes.

Atenção: Todos os materiais potencialmente infecciosos devem ser manuseados de acordo com as normas de biossegurança nível 2, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual. Quaisquer procedimentos que podem produzir aerossol devem ser executados em uma armário de biossegurança. Além disso, trabalho com mosquitos ao vivo deve ser realizado nas instalações adequadas artrópode contenção nível 1-3. Dada a associação da infecção ZIKV com anomalias congênitas, mulheres grávidas, tentando engravidar, ou os parceiros dessas mulheres devem minimizar significativamente sua exposição laboratorial para ZIKV. Transporte de amostras ZIKV é classificado nos EUA como categoria B substâncias biológicas em conformidade com o departamento de transporte perigosos materiais regulamentos (49 CFR parte 171-180) e, portanto, amostras do transporte devem aderir aos diretrizes. Importação para os Estados Unidos da ZIKV biospecimens requer um centros para controle de doenças e prevenção (CDC) autorização de importação. Importação de qualquer artrópodes que poderia servir como um vetor para a transmissão de ZIKV, mesmo se eles não estão infectados, exige uma autorização do departamento de agricultura dos Estados Unidos (USDA). Esta informação é atual no momento da publicação. Recomendações atualizadas podem ser encontradas em https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

Nota: RT-lâmpada reações são propensas a taxas mais elevadas de reações falso-positivas, assim que devem ser tomadas precauções no planejamento experimental. Todos os set-up e execução de reações RT-lâmpada devem usar pipetas designadas e filtro dicas. Idealmente, deve ser estabelecido um fluxo de trabalho lateral. Se possível, a análise e imaging (secção 5) devem ocorrer em uma sala fechada para evitar a contaminação. Abertura dos tubos de ensaio contendo produtos de RT-lâmpada deve ser mantida a um mínimo.

1. RT-lâmpada Primer preparação

1. Reconstitua cada cartilha RT-lâmpada liofilizada em água de grau molecular para uma concentração final de 100 µM (tabela 1). Brevemente o vórtice da solução de primer para garantir uma solução homogénea e brevemente spin para baixo a solução na velocidade máxima em uma centrífuga de mesa para coletar toda solução da primeira demão.
2. Preparar um 10 x RT-lâmpada Primer Mix dos primers FIP, BIP, F3, B3, se e LB usando os volumes na tabela 2. Brevemente o vórtice da solução de primer para garantir uma solução homogênea e brevemente spin para baixo a solução na velocidade máxima em uma centrífuga de mesa para evitar qualquer perda.
   Nota: O primer RT-lâmpada para actina Ae. aegypti (AEDAE) não contém um primer LB (loop primers nem sempre são necessárias para as reações de RT-lâmpada). Neste caso, substitua o volume da primeira demão LB água molecular da classe.
3. Armazenar os primers a-20 ° C entre utilizações e evitar ciclos de degelo-livre.

2. preparação da amostra

1. Para amostras de urina humana: Use a urina fresca, congelada de urina ou urina no conservante. Para amostras frescas ou congeladas: imediatamente girar a amostra após a coleta por 10 min a 700 x ge usar o sobrenadante para análise ou congelar a-80 ° C para uso futuro. Descongele as amostras congeladas no gelo antes de usar.
2. Para amostras de soro humano: Use também amostras de soro fresco ou congelado.
3. Para ZIKV infectado linhas celulares: usar mídia condicionadas ou lisados celulares.
   Nota: Sem célula condicionado mídia de Ae. albopictus C6/36 células 8 dias pós infecção pode ser usado como controles positivos para reações ZIKV RT-lâmpada.
4. Para mosquitos Ae. aegypti : usar carcaças ou mosquito inteiro fresco ou congelado. Descongele os mosquitos congelados no gelo. Preparar um mosquito bruto lisado colocando um mosquito individual em 100 µ l de tampão fosfato salino (PBS) e homogeneizar, esmagando o mosquito 10 vezes com uma ponta da pipeta P10 (Figura 1). Brevemente centrifugar o bruto lisado de quaisquer detritos de Pelotas. Use o sobrenadante para análise de RT-lâmpada a jusante.
   Nota: Controlos positivos podem ser gerados em uma configuração de laboratório infectando mosquitos fêmeas utilizando microinjeção intratorácicos com aproximadamente 10³ equivalentes de genoma do vírus em um volume de 200 nL e colheita o mosquito 5 dias pós-infecção.

3. prepare o RT-lâmpada Master Mix

1. Prepare uma reação de mistura mestre RT-lâmpada no gelo para cada primeira demão definida para ser usado por meio de guia volume na tabela 3.
   Nota: O uso de termolábil Uracil DNA Glycosylase (UDG) auxilia na prevenção de falsos positivos.
2. Vórtice brevemente para garantir que todas as amostras são bem misturadas, então spin para baixo rapidamente para evitar a perda de volume.

4. ensaio de RT-lâmpada

1. Pipeta 23,0 µ l do mix mestre RT-lâmpada por reação em um tubo PCR de 200 µ l. Adicione 2,0 µ l de amostra (urina, soro ou sobrenadante lisado de mosquito bruto conforme descrito na etapa 2). Isto trará o volume total a 25,0 µ l por reação de RT-lâmpada. Para o controle negativo, use água de grau molecular. Inclua um controlo positivo.
   Nota: Uma PCR padrão ou vírus as existências do sobrenadante de linhas de células infectadas podem ser usado como controle positivo.
   1. Opcional: Inclua uma reação de controle de especificidade de um arbovírus relacionados tais como o vírus da dengue (DENV). Prepare a amostra conforme descrito na etapa 2 de acordo com o tipo de amostra. Adicione 2,0 µ l de controlo a especificidade a 23.0 µ l do mix mestre RT-lâmpada para um tubo de PCR de 200 µ l.
2. As amostras a 61 ° C durante 30 minutos usando um bloco de calor, banho de água ou thermocycler do calor.
3. Calor desactivar o polymerase por aquecimento a 80º C por 10 min.

5. análise de RT-lâmpada

Nota: Execute análise de RT-lâmpada num espaço separado e fechado.

1. Após a incubação, acessar reações RT-lâmpada visualmente, procurando a presença de uma alteração de cor.
   1. Dilua o fluorescente ácido nucleico tintura 01:10 em tampão TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM, 1 mM EDTA).
      Atenção: Qualquer mancha de ácido nucleico vincula aos ácidos nucleicos e, portanto, é uma substância cancerígena. Use luvas ao manusear.
   2. A 12 µ l da reação de RT-lâmpada, adicione 2 µ l da diluição do corante fluorescente do ácido nucleico.
      Nota: Reações negativas será laranja na cor e reações positivas será na cor verde/amarelo.
   3. Opcional: Tirar fotos de reações RT-lâmpada sobre um fundo branco usando uma câmera.
2. Coloca as amostras sob 302 nm UV luz para confirmar a presença de produtos de RT-lâmpada por fluorescência. Tire foto do resultado usando uma câmera.
   Nota: Reações positivas RT-lâmpada terá uma saída fluorescente.
   Cuidado: Use escudo de googles ou rosto de olho protetor UV quando trabalhar com luz UV.
3. Opcional: Confirme a presença de RT-lâmpada produtos por meio de eletroforese em gel de amostras.
   1. Despeje um gel de agarose 2% em 1 x TAE buffer com uma mancha de ácidos nucleicos para visualização.
      Atenção: Qualquer mancha de ácido nucleico vincula aos ácidos nucleicos e, portanto, é uma substância cancerígena. Use luvas ao manusear.
   2. Adicione 5 µ l de uma escada de DNA a primeira pista para comparar os pesos moleculares.
   3. Para cada reação de RT-lâmpada, misture 13 µ l da mistura de reação de RT-lâmpada com 2 µ l de DNA tintura de carregamento. Carrega a mistura de 15 µ l contendo o DNA de tintura de carregamento.
   4. Execute o gel em 90 V por 90 min ou até que as bandas são separadas e imagem com a luz de UV 302 nm.
      Nota: Reações positivas RT-lâmpada terá um padrão de laddering. Reações negativas RT-lâmpada não devem conter nenhuma banda.

6. eliminação

1. Descarte de reações RT-lâmpada em sacos selados duplos. Fazer não Autoclavar o que isso pode aerosolize os produtos RT-lâmpada, levando a reações falso-positivas no futuro.

Resultados

Reações de RT-lâmpada podem ser analisadas usando três métodos diferentes. Primeiro, com a adição de um corante fluorescente de ácidos nucleicos, reações positivas será na cor verde/amarelo onde reações negativas aparecerão laranja na cor a olho nu. Em segundo lugar, a adição do corante para reação de RT-lâmpada fluorescente de ácidos nucleicos resulta em um sinal fluorescente quando as amostras são excitadas pela luz UV. Reações negativas não terá um sinal fluore...

Discussão

O ensaio de ZIKV RT-lâmpada descrito neste papel de trabalhos usando tanto humanos como mosquito amostras⁶. O limite de detecção foi de aproximadamente 1 genoma equivalente⁶, que devem ser suficientes, desde que a carga viral típica de um paciente ZIKV infectado sintomático é 10³ a 10⁶ PFU/mL⁷. Além disso, este método pode detectar ZIKV em amostras sem primeiro isolamento de RNA e sem amplificação do vírus...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380S
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP Solution	New England Biolabs	N0440S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dCTP Solution	New England Biolabs	N0441S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dTTP Solution	New England Biolabs	N0443S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dGTP Solution	New England Biolabs	N0442S	Deoxynucleotide Set N0446S
100 mM dUTP Solution	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	10816015
Primers	Integrated DNA Technologies	Custom Oligo
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9938
Urine Preservative	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR Standard	Robert Koch Institute	N/A	Vero E6 cell supernatants
DENV2 New Guinea C Control	Connecticut Agricultural Experiment Station	N/A