هوفيك أنبوب تشكيل التبوّع تقييم تأثير المنتجات الطبيعية على تكوين الأوعية الدموية

Summary

هنا، نقوم بتقييم آثار استخراج المياه من روتا graveolens على تشكيل شبكة السفينة باستخدام اختبار تشكيل أنبوب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية.

Abstract

تكوين الأوعية هو ظاهرة تشمل عمليات مختلفة، مثل انتشار الخلايا البطانية، والتمايز، والهجرة، التي تؤدي إلى تشكيل الأوعية الدموية الجديدة وتنطوي على العديد من مسارات نقل الإشارات. هنا نبين أن اختبار تشكيل الأنبوب هو طريقة بسيطة في المختبر لتقييم تأثير المنتجات الطبيعية على تكوين الأوعية الدموية والتحقيق في الآليات الجزيئية المعنية. على وجه الخصوص، في وجود استخراج المياه من روتا graveolens (RGWE)، الخلايا البطانية لم تعد قادرة على تشكيل شبكة خلية الخلية، وأنه يتم إلغاء آثار RGWE على تكوين بطانة الوريد السري البشري (HUVEC) من قبل تفعيل تأسيسي لMEK.

Introduction

تكوين الأوعية الدموية هو عملية فسيولوجية تؤدي إلى تشكيل أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة من قبل وتحدث أثناء تكوين الأجنة ونمو الأعضاء. في مرحلة البلوغ، يتم تنشيط تكوين الأوعية الدموية فقط في المبيض ركوب الدراجات، في المشيمة أثناء الحمل، وخلال التئام الجروح وإصلاحها. يعتمد تكوين الأوعية الدموية على قدرة الخلايا البطانية على التكاثر والتميز والهجرة لتشكيل شبكة الأوعية الدموية سليمة¹. ومع ذلك، في العديد من الاضطرابات، مثل الأمراض الالتهابية، والأيض، والروماتيزم، يتم تغيير العمليات الوعائية وتصبح الأوعية الدموية مفرطة. وعلاوة على ذلك، فإن العمليات الوعائية غير المنضبطة تحفز أيضا تطور الورم والانبثاث¹. لهذه الأسباب، في العقد الماضي، تركز الدراسات البحثية على وضع استراتيجيات علاجية جديدة تهدف إلى تثبيط تكوين الأوعية الدموية المفرط في السرطان، العين، المفاصل، أو اضطرابات الجلد^2،3.

يمثل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) الهدف الرئيسي للعلاجات المضادة للأوعية الدموية الحالية⁴، وقد تم تطوير العديد من الأجسام المضادة للمونوكلونات المضادة للVEGF وتوليفها لمنع تكوين الأوعية الدموية المفرط. ومع ذلك، فإن هذه الأدوية الاصطناعية تظهر آثار جانبية شديدة ولها نسبة تكلفة إلى فائدة غير مواتية^5،6. ولذلك، لا بد من إيجاد استراتيجيات علاجية جديدة للحد من تكوين الأوعية الدموية المفرط مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية لاستكمال والجمع مع الأدوية المستخدمة حاليا. ويمكن العثور على هذه الأدوية الجديدة بين المنتجات الطبيعية التي تتميز بتنوع كيميائي عال وخصوصية البيوكيميائية.

في هذه المقالة، نقترح طريقة بسيطة لتقييم تأثير RGWE على قدرة HUVECs لتشكيل الأنابيب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية في المختبر⁵. في الواقع، RGWE هو خليط من الأيض الثانوية مثل الفلافونويدات والبوليفينول من بينها روتين هو المكون الرئيسي⁵. وقد تم بالفعل اختبار العديد منهم كعوامل مضادة للالتهابات وvasoprotective^{7،8،9،10،11}. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا مؤخرا أن RGWE، ولكن ليس روتين، قادرة على تثبيط قدرة HUVEC على تشكيل الأنابيب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية، وأن هذه الظاهرة يتم التوسط من قبل مسار MEK-ERK، مما يشير إلى RGWE كأداة علاجية محتملة قادرة على منع الإفراط في تشكيل الأوعية الدموية الجديدة⁵.

Protocol

1. إعداد RGWE

1. جمع أوراق R. graveolens من النباتات خلال أشهر الربيع / الصيف تحت إشراف عالم النبات.
   ملاحظة: في هذه الحالة، تم جمع الأوراق في القسم التجريبي من النباتات الطبية في الحديقة النباتية في نابولي، إيطاليا⁵. المصنع عفوي، دائم، وهو موجود في مناطقالبحر الأبيض المتوسط (الشكل 1).
2. تزن 250 غرام من الأوراق وتقطيعها ناعما مع مقص.
3. ضعي الأوراق في قارورة مخروطية وأضيفي 1 لتر من الماء المقطر إلى 250 غرام من الأوراق المفرومة واغليها عند درجة حرارة 110 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
4. استخدم ورق فلتر 3 مم قمع لفصل الأوراق المسلوقة من المرحلة السائلة التي تمثل استخراج المياه.
5. تصفية المرحلة السائلة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، وجمعها في كوب. تغطية الكأس مع بارافيلم وتجميد استخراج في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
6. جعل 10 - 15 ثقوب مع إبرة في parafilm وlyophilize استخراج في lyophilizer. لاحظ أنه يمكن أن يستغرق بضعة أيام للحصول على مسحوق.
7. وزن المسحوق الذي تم الحصول عليه، وتقسيمه إلى aliquots، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الضرورة. فمن الممكن لتخزينه لمدة عام.
8. عند الضرورة للتجارب، وإعداد حل الأسهم، والتخفيف من مسحوق بالماء المقطر إلى تركيز قياسي من 50 ملغ / مل. قم بفصله إلى كميات صغيرة (على سبيل المثال، 1 مل) aliquots. يمكن تخزين هذا الإعداد في -20 درجة مئوية حتى تستخدم ولكن لا يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لأكثر من بضعة أيام بسبب أكسدة الجزيئات. تجنب التجميد والذوبان.

2. خلية الثقافة

1. زراعة HUVECs في متوسط نمو الخلايا البطانية: متوسطة القاعدية البطانية تكملها 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون و 1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، 10٪ FBS، والبنسلين/ العقديات في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
2. عندما 80٪ confluent، وتقسيم الخلايا في نسبة 1:3 كل ممر. استخدام الخلايا من اثنين إلى خمسة مقاطع، التي لا تظهر اختلافات واضحة في الاستجابة لعوامل النمو. بعد المقطع السادس، تصبح الخلايا مُسنة ولا تشكل أنابيب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية.

3- التغوط

1. عندما تكون HUVECs 70٪ مترافقة، transfect لهم مع الجين المطلوب.
2. بالنسبة للوحة 100 مم، استخدم 1 ميكروغرام من متجه pCDNA3 الفارغ كتحكم و1 ميكروغرام من متجه pCDNA3 الذي يحتوي على جين الفائدة (MEK النشط بشكل تأسيسي [caMEK]، في هذه الحالة).
3. مركب 1 ميكروغرام من الحمض النووي مع 3 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000، مخفف ة مع انخفاض مصل متوسط (انظر جدولالمواد) إلى الحجم النهائي من 200 درجة مئوية. ثم، إضافة الحل transfecting إلى الخلايا. حضانة الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية،مع 5٪ CO 2. ومن الممكن أيضا استخدام عوامل التغوط الأخرى مختلفة عن lipofectamine 2000، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. إضافة 7 مل من المتوسطة الطازجة كاملة 3 ح بعد التغوط، وبعد ذلك، مزيد من احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 - 48 ساعة قبل المضي قدما في الاختبارات التالية. في اليوم التالي للتغوط، استبدل المتوسط بوسط جديد كامل.

4. أنبوب تشكيل التبيّاع

1. تبرد لوحة 96 جيدا ونصائح ماصة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل إعداد الطابق السفلي الهلامي.
2. في لحظة التحضير الطابق السفلي، ووضع لوحة على الجليد (0 درجة مئوية) وإضافة 50 درجة مئوية من المصفوفة الباردة في كل بئر مع تجنب تشكيل فقاعات. لاحظ أنه يجب الاحتفاظ بالقارورة التي تحتوي على المصفوفة على الجليد أثناء الإجراء حيث تصبح المصفوفة صلبة في درجة حرارة الغرفة.
3. وضع لوحة في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للقبو للبلمرة.
4. في هذه الأثناء، حصاد الخلايا. غسل HUVECs مع 1 مل من 0.25٪ تريبسين / 0.53 مليون متر EDTA الحل؛ ثم، إضافة 2 مل من الحل التربسين-EDTA وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم، جمع المتوسطة التي يتم تعليق الخلايا وحصاد الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي في 264 × ز لمدة 3 دقائق.
5. لحساب الخلايا، إضافة 0.2 مل من تعليق الخلية إلى 0.5 مل من PBS و 0.3 مل من 0.4٪ trypan الحل الأزرق. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، عد الخلايا في غرفة Bürker.
6. إعادة تعليق الخلايا في وسط كامل في تركيز 2 × 10⁴ خلايا / 50 درجة مئوية.
7. إيلاء الاهتمام لعدد من الخلايا. قد لا تشكل خلايا كثيرة جداً أو قليلة جداً أنابيب في الطريق الصحيح على الطابق السفلي الهلامي.
8. إعداد جرعات متزايدة من RGWE (0.01, 0.1, و 1 ملغ /مل), تخفيف محلول المخزون في الثقافة المتوسطة أو روتين (12, 120, و 300 ميكروغرام /مل), كل ذلك في المجلد النهائي من 50 € L / بئر, وإضافتها إلى 50 درجة مئوية / جيدا من تعليق الخلية. الحجم النهائي في كل بئر سيكون 100 درجة مئوية. إعداد أربعة إلى ستة آبار لكل حالة تجريبية. كتحكم, يخفّف يقطر يقطر ماء (عربة) في الثقافة وسط في نسبة من 1:50.
9. حضانة الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لفترة تتراوح بين 6 إلى 24 ساعة.
10. مراقبة الخلايا في غضون نطاق زمني يمتد من 6 إلى 24 ساعة بعد البذر، وذلك باستخدام مجهر على النقيض من المرحلة في التكبير من 10X. HUVECs قادرة على تشكيل هياكل تشبه أنبوب في غضون 6 ح ولكن من الممكن أن نلاحظ نتائج أفضل بعد 12-18 ح. صورة الهياكل مثل أنبوب على كل بئر وصورة في المتوسط من ثلاثة إلى خمسة حقول عشوائية في كل بئر.
11. بعد الحصول على الصورة، يمكن فصل الخلايا من مصفوفة الطابق السفلي وتحسب لتقييم تأثير العلاج على عدد الخلايا. لكل بئر، إزالة المتوسطة، إضافة dispase في تركيز 24 U / مل، ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم، من كل بئر، وجمع المتوسطة التي يتم تعليق الخلايا وحصاد الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي في 264 × ز لمدة 3 دقائق. لحساب الخلايا، إضافة 0.2 مل من تعليق الخلية إلى 0.5 مل من PBS و 0.3 مل من 0.4٪ trypan الحل الأزرق. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، عد الخلايا في غرفة Bürker.
12. لتحديد نتائج عملية تحديد تشكيل الأنبوب، من الممكن حساب عدد نقاط الفرع التي تنضم إليها ثلاثة أنابيب على الأقل. باستخدام برنامج الصورة المناسب، عد لكل حقل في كل ميكروغراف عدد نقاط الفرع وحساب متوسط ± الخطأ القياسي (SE) لكل حالة تجريبية. استخدم اختبار t-tailed ذو ذيلين لتقييم الأهمية الإحصائية.

النتائج

لتقييم تأثير RGWE على تكوين الأوعية الدموية، قمنا بفحص تشكيل أنبوب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية. عندما تزرع على ذلك، HUVECs تشكيل هياكل تشبه أنبوب التي تنشأ من الخلايا التي تظهر ممدود التي تربط بعضها البعض لتشكيل شبكة خلية الخلية (الشكل2). في ا?...

Discussion

تتميز المركبات الطبيعية بتنوع كيميائي عال وخصوصية كيميائية حيوية وتمثل مصدرا للجزيئات العلاجية المحتملة. هنا، نعرض كيفية الحصول على مستخلص المياه من النبات R. graveolens واقتراح اختبار تشكيل أنبوب كطريقة سهلة الأداء وموثوق بها، وكمية مفيدة للتحقيق في آثار RGWE على تكوين الأوعية الدموية. م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can