HUVEC tüp-formasyon assay doğal ürünlerin anjiyogenezi üzerinde etkisini değerlendirmek için

Özet

Burada, biz su ekstresinin etkilerini değerlendirmek Ruta graveolens gemi ağ oluşumu üzerinde bir tüp oluşumu tahlil kullanarak bir jelli Bodrum matris.

Özet

Angiogenesis, endotel hücre proliferasyonu, farklılaşma ve göç gibi farklı süreçler içeren, yeni kan damarlarının oluşumuna yol açabilecek ve çeşitli sinyal iletim yollarından oluşan bir olgudur. Burada, tüp oluşumu tahlil doğal ürünlerin anjiyogenez üzerinde etkisini değerlendirmek ve ilgili moleküler mekanizmaları araştırmak için basit bir in vitro yöntemi olduğunu göstermektedir. Özellikle, Ruta graveolens (rgwe) su özü varlığı, endotel hücreleri artık bir hücre hücre ağı oluşturmak mümkün ve insan göbek ven endotel hücre üzerinde rgwe etkileri (HUVEC) tüp oluşumu tarafından kaldırılmıştır MEK kurucu aktivasyonu.

Giriş

Angiogenesis, önceden mevcut olanlarla yeni kan damarlarının oluşumuna yol açan ve embriyogenit ve organ büyümesi sırasında meydana gelen fizyolojik bir süreçtir. Yetişkinlikte, anjiyojenez sadece bisiklet yumurtası, gebelik sırasında plasenta, ve yara iyileşmesi ve onarımı sırasında aktive edilir. Anjiyojenez, endotelyal hücrelerin çoğalmasına, farklılaştırmaya ve bozulmamış bir vasküler ağ oluşturmak için göç edebilme yeteneğine bağlıdır¹. Ancak, enflamatuar, metabolik ve romatizmal hastalıklar gibi çeşitli hastalıklarda anjiyojenik süreçler değiştirilir ve anjiyojenez aşırı olur. Ayrıca, kontrollü anjiyojenik süreçler de tümör progresyonu ve metasrik¹uyarır. Bu nedenlerden dolayı, son on yıl içinde, araştırma çalışmaları kanser, oküler, eklem veya cilt bozuklukları^2,3aşırı anjiyogenezi inhibisyonu amaçlayan yeni terapötik stratejilerin gelişmesine odaklanmaktadır.

Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) mevcut antianjiyojenik tedavilerin ana hedefini temsil eder⁴, ve birçok ANTI-VEGF monoklonal antikorlar geliştirilmiştir ve aşırı anjiyogenezi önlemek için sentezlenmiş. Ancak, bu sentetik ilaçlar şiddetli yan etkileri gösterir ve olumsuz maliyet-to-fayda oranı^5,6var. Bu nedenle, tamamlayıcı ve şu anda kullanılan ilaçlar ile birleştirmek için minimal yan etkileri ile aşırı anjiyogenezi sınırlamak için yeni terapötik stratejiler bulmak zorunludur. Bu yeni ilaçlar, yüksek kimyasal çeşitlilik ve biyokimyasal özgüllük ile karakterize doğal ürünler arasında bulunabilir.

Bu yazıda, RGWE 'nin HUVECs 'in bir jelli Bodrum Matrix in vitro⁵' te tübüller oluşturabilme yeteneğinin etkisini değerlendirmek için basit bir yöntem öneriyoruz. Nitekim, rgwe gibi flavonoidler ve polifenoller gibi ikincil metabolitlerin bir karışımı olan rutin büyük bileşen⁵. Birçoğu zaten anti-inflamatuar ve vazokoruyucu ajanlar olarak test edilmiştir^7,8,9,10,11. Dahası, Geçenlerde göstermiştir ki RGWE, ama rutin değil, HUVEC yeteneği bir jelli Bodrum matrisinde tübüller oluşturmak için inhibe edebiliyoruz ve bu fenomen MEK-ERK yolu tarafından aracılı olduğunu, potansiyel bir tedavi aracı olarak RGWE gösteren mümkün aşırı yeni kan damar oluşumu önlemek⁵.

Protokol

1. RGWE hazırlık

1. Toplamak R. graveolens bir botanikçi gözetiminde ilkbahar/yaz aylarında bitkilerin yaprakları.
   Not: Bu durumda, yaprakları Napoli Botanik Bahçesi 'nde şifalı bitkiler deneysel bölümünde toplanan, Italya⁵. Bitki spontan, çok yıllık ve Akdeniz bölgelerinde mevcut (Şekil 1).
2. Tartmak 250 g yaprakları ve ince makas ile onları doğrayın.
3. Bir konik Flask yaprakları koymak ve 1 L damıtılmış su eklemek 250 g doğranmış yaprakları ve bir kaynatmak için 110 °C ' de 60 dakika için getirmek. aşırı buharlaşma önlemek için alüminyum folyo ile Flask kapak.
4. Su özü temsil eden Sıvı fazdan haşlanmış yaprakları ayırmak için 3 mm-huni filtre kağıdı kullanın.
5. Sıvı fazı bir 0,22 μm filtre ile filtreleyebilir, bir Beaker içinde toplayın. Parafilm ile kabı kapak ve ekstresi dondurmak-80 °c gece.
6. Parafilm bir iğne ile 10-15 delik yapmak ve bir lyophilizer ekstresi lyophilize. Toz elde etmek için birkaç gün sürebilir unutmayın.
7. Elde edilen tozu tartın, onu aliquots 'a böler ve gerekli olana kadar 4 °C ' de saklayın. Bir yıl boyunca saklamak mümkündür.
8. Deneyler için gerekli olduğunda, bir stok çözüm hazırlamak, standart bir konsantrasyon 50 mg/mL damıtılmış su ile toz seyreltilmesi. Küçük hacimli (örn. 1 mL) farklı bir şekilde ayırın. Bu hazırlık, kullanılıncaya kadar-20 °C ' de depolanabilir ancak moleküllerin oksidasyonları nedeniyle birkaç gün boyunca 4 °C ' de depolanamaz. Dondurmayı ve çözülme kaçının.

2. hücre kültürü

1. Endotel hücre büyüme ortamında HUVECs yetiştirmek: endotel bazal orta 1 μg/mL hidrokortizon ve 1 ng/mL epidermal büyüme faktörü,% 10 FBS ve penisilin/Streptomycin 37 °C ' de 5% CO₂atmosferinde tamamlayıcı olarak desteklenmektedir.
2. Zaman 80% confluent, her geçit 1:3 oranında Hücreleri Böl. Büyüme faktörlerine yanıt olarak belirgin farklar göstermez iki ila beş pasajlar, hücreleri kullanın. Altıncı geçişte sonra, hücreler parlak hale gelir ve jelli Bodrum matrisinde tüpler oluşturmayın.

3. transfeksiyon

1. HUVECs% 70 konfluent olduğunda, istenilen gen ile transfekt.
2. 100 mm 'lik bir plaka için, kontrol olarak 1 μg boş pCDNA3 vektörü ve ilgi geni (Bu durumda kurucu aktif MEK [caMEK]) içeren 1 μg pCDNA3 vektörü kullanın.
3. 3 μL lipofektamin 2.000 ile karmaşık 1 μg DNA, azaltılmış serum orta ile seyreltilmiş (bkz. malzeme tablosu) 200 μL son hacmine. orta hücrelerden çıkarın ve 1 ml taze komple orta ile değiştirin; ardından, transfendirme çözümünü hücrelere ekleyin. 37 °C ' de,% 5 CO₂ile kuluçinörün hücrelerine inkübe edilir. Ayrıca, üreticinin talimatlarını takiben, lipofektamin 2.000 farklı diğer transfeksiyon ajanlar kullanmak mümkündür.
4. Transfeksiyondan sonra 7 mL komple taze orta 3 h ekleyin ve sonra, daha sonra 37 °C ' de hücreler için 24-48 h ile bir sonraki ilerlemeler devam etmeden önce inküye yapın. Transfeksiyon sonrası gün, orta taze komple orta ile değiştirin.

4. tüp oluşumu tahlil

1. Serin bir 96-kuyu plaka ve Pipet uçları 4 °C ' de 1 saat boyunca jelli Bodrum hazırlanmadan önce.
2. Bodrum hazırlık anda, buz üzerine plaka koymak (0 °C) ve ekleyin 50 her iyi soğuk matris μL eklemek kabarcıklar oluşumundan kaçınarak. Matris oda sıcaklığında katı hale gelen bu yana prosedür sırasında matris içeren şişe buz üzerinde tutulması gerektiğini unutmayın.
3. En az 30 dakika için% 5 CO₂ Ile 37 °c ' de kuluçvanın plakasını yerleştirin ve bodrumun polimerize edilmesini sağlar.
4. Bu arada, hücreleri topla. HUVECs 'i 1 mL 'Lik bir 0,25% Trypsin/0.53 mM EDTA çözeltisi ile yıkayın; sonra, Trypsin-EDTA çözeltisi 2 mL ekleyin ve 5 dakika için 37 °C ' de inküye. hücre katmanının tamamen dağınık olduğunu doğrulamak için ters bir mikroskop altındaki hücreleri Inceleyin. Sonra, hücrelerin askıya alındığı orta toplamak ve 3 dakika için 264 x g santrifüjleme ile ayrılmış hücreleri hasat 1 ml fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) onları resuspend.
5. Hücreleri saymak için 0,2 mL PBS 0,5 mL ve 0,3 mL% 0,4 tripan mavi çözeltisi hücre süspansiyonu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, bir BüRkEr odasında hücreleri saymak.
6. 2 x 10⁴ hücreli/50 μL konsantrasyonunda tam ortamda hücreleri resuspend. 2 x 10⁴ hücrelerin konsantrasyonunda jelli Bodrum üzerine tohum ve onlara yerleşmek izin.
7. Hücrelerin sayısına dikkat edin. Çok fazla veya çok az hücre, jel Bodrum üzerinde doğru şekilde tüpler oluşturmayabilir.
8. Artan doz RGWE hazırlayın (0,01, 0,1, ve 1 mg/mL), kültür orta veya rutin (12, 120, ve 300 μg/mL) stok solüsyonu seyreltilmesi, tüm son hacim içinde 50 μL/Well, ve onları ekleyin 50 μL/Well hücre süspansiyonu. Her kuyunda son hacim 100 μL olacaktır. Her deneysel durum için dört ila altı kuyu hazırlayın. Bir kontrol olarak, 1:50 oranında kültür ortamında distile su (araç) seyreltik.
9. 37 °C ve 5% CO₂ ' de kuluçoradaki hücreleri 6 ila 24 saat arasında değişen bir süre için inkübe etmek.
10. 6 ' dan 24 saat tohumdan sonra yayılan bir zaman aralığında hücreleri gözlemlemek, 10X büyütme bir faz kontrast mikroskop kullanarak. HUVECs 6 h içinde tüp benzeri yapıları oluşturmak edebiliyoruz ama 12-18 h sonra daha iyi sonuçlar gözlemlemek mümkündür. her bir kuyu üzerinde tüp benzeri yapıları fotoğraf ve her iyi üç ila beş rasgele alanlara ortalama görüntü.
11. Görüntü satın aldıktan sonra, hücreler Bodrum matrisinden ayrılabilir ve tedavinin hücre sayısına etkisini değerlendirmek için sayılır. Her bir kuyu için, orta çıkarın, 24 U/mL konsantrasyonunda dispaz ekleyin ve 1 saat için 37 °C ' de plaka koymak. Sonra, her iyi, hangi hücrelerin askıya alınır ve 3 dk için 264 x g santrifüjleme ile ayrılmış hücreleri hasat orta toplamak 0,2 ml PBS onları resuspend. Hücreleri saymak için 0,2 mL PBS 0,5 mL hücre süspansiyonu ve 0,3 mL% 0,4 tripan mavi çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, BüRkEr odasındaki hücreleri saymak.
12. Tüp oluşumu tahlil sonuçlarını ölçmek için, en az üç tüp katılmak şube noktalarının sayısını saymak mümkündür. Uygun görüntü yazılımını kullanarak, her mikrografadaki her alan için şube noktalarının sayısını saymak ve ortalama ± standart hata (SE) her deneysel koşul için hesaplayın. İstatistiksel önemini değerlendirmek için iki kuyruklu t-testi kullanın.

Sonuçlar

Rgwe 'nin anjiyogenezi üzerinde etkisini değerlendirmek için, bir tüp oluşumu tahlili, bir jel Bodrum matrisinde yürütülmüştür. Üzerine yetiştirdiğinizde, HUVECs, uzatılmış görünen ve birbirleriyle bir hücre hücresi ağı oluşturmak için birbirine bağlayan hücrelerden kaynaklanan tüp benzeri yapıları oluşturur (Şekil 2). Şekil 3' te, biz kontrol koşullarına kıyasla rgwe Ile tedavi HUVECs dalları...

Tartışmalar

Doğal bileşikler yüksek kimyasal çeşitlilik ve biyokimyasal özgüllük ile karakterize ve potansiyel olarak terapötik moleküllerin bir kaynağını temsil eder. Burada, biz bitki R. graveolens su özü elde etmek için nasıl göstermek ve bir kolay gerçekleştirmek için tüp oluşumu tahlil önermek, güvenilir, ve nicel yöntemi anjiyojenez ÜZERINDE rgwe etkilerini araştırmak için yararlı. Bu R. graveolens yaprakları kaynatmak için önemlidir 1 h tam su özü elde emin olmak için. Da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can