HUVEC 管形成测定评估天然产物对血管生成的影响

摘要

本文利用凝胶基底基体上的管形测定,评估鲁塔墓构的水萃取物对血管网络形成的影响。

摘要

血管生成是一种包括不同过程的现象,如内皮细胞增殖、分化和迁移,导致新血管的形成,并涉及多个信号转导途径。这里我们表明,管形成测定是一种简单的体外方法,用于评估天然产物对血管生成的影响,并研究所涉及的分子机制。特别是,在Ruta真分子(RGWE)的水提取物存在的情况下,内皮细胞不再能够形成细胞网络,RGWE对人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC)管的形成的影响被废除MEK的构成激活。

引言

血管生成是一个生理过程,导致从先前存在的血管形成新的血管,并在胚胎生成和器官生长期间发生。在成年后,血管生成仅在循环卵巢、妊娠期间胎盘以及伤口愈合和修复期间激活。血管生成取决于内皮细胞增殖、分化和迁移的能力,从而形成完整的血管网络1。然而,在几种疾病,如炎症,代谢和风湿病,血管生成过程被改变和血管生成变得过度。此外,不受控制的血管生成过程也刺激肿瘤进展和转移1。由于这些原因,在过去十年中,研究的重点是开发新的治疗策略,旨在抑制癌症,眼,关节,或皮肤疾病的过度血管生成2,3。

血管内皮生长因子(VEGF)是当前抗血管生成^疗法4的主要目标,并开发和合成了几种抗VEGF单克隆抗体,以防止血管生成过度。然而,这些合成药物表现出严重的副作用,并且有不利的成本效益比5,6。因此,必须找到新的治疗策略,以限制过度血管生成与最小的副作用,以补充和结合目前使用的药物。这些新药可以在具有高化学多样性和生化特异性的天然产品中找到。

本文提出了一种评估RGWE对HUVEC在体外凝胶基底基质上形成小管能力影响的简单方法。事实上,RGWE是亚次代谢物的混合物,如黄酮类化合物和多酚,其中鲁丁是主要成分5。他们中的许多人已经测试为抗炎和血管保护剂7,8,9,10,11。此外,我们最近已经证明,RGWE,但不是鲁丁,能够抑制HUVEC的能力,形成细胞在凝胶基底基质,这种现象是由MEK-ERK通路,表明RGWE作为一个潜在的治疗工具,能够防止过度的新血管形成5。

研究方案

1. RGWE 准备

1. 在植物学家的监督下,在春季/夏季从植物中收集R. 坟墓叶。
   注:在这种情况下,叶子被收集在意大利那不勒斯植物园的药用植物实验科5。该植物是自发的,多年生,并存在于地中海地区(图1)。
2. 称量250克叶子,用剪刀切碎。
3. 将叶子放入圆锥形烧瓶中,将1升蒸馏水加入250克切碎的叶子中,在110°C下煮沸60分钟。用铝箔覆盖烧瓶,避免过度蒸发。
4. 使用 3 毫米漏斗滤纸将煮沸的叶子与代表水提取物的液相分离。
5. 通过 0.22 μm 过滤器过滤液相,将其收集到烧杯中。用副膜盖住烧杯,并在-80°C冷冻提取物过夜。
6. 在副胶片中用针打10-15个孔,在冻干剂中冻干提取物。请注意,可能需要几天时间才能获得粉末。
7. 称量所得粉末,将其分成等分,并将其储存在4°C,直到必要为止。可以存放一年。
8. 当实验需要时,准备一个库存溶液,用蒸馏水稀释粉末到50mg/mL的标准浓度。将其分成小体积(例如 1 mL)等分。这种制剂可以储存在-20°C,直到使用,但不能在4°C储存超过几天,因为分子的氧化。避免冻结和解冻。

2. 细胞培养

1. 在内皮细胞生长培养基培养中:内皮基础介质辅以1微克/mL氢皮质酮和1纳克/mL表皮生长因子,10%FBS,在37°C的大气中青霉素/链霉素在5%CO₂的大气中。
2. 当80%的汇入时,以每通道1:3的比例分裂细胞。使用2到5个段落的细胞,这些段落在响应生长因子时没有明显的差异。第六段后,细胞变得衰老,不会在凝胶基底基质上形成管。

3. 转染

1. 当HUVECs是70%的汇出,转染他们与所需的基因。
2. 对于100毫米板,使用1μg空pCDNA3载体作为对照,使用1μg的pCDNA3载体,其中包含感兴趣的基因(在这种情况下,具有组织活性的MEK[caMEK])。
3. 复合1μg的DNA与3μL的利莫他明2,000,稀释与减少的血清介质(见材料表)到200μL的最终体积。从细胞中取出该培养基,并替换为1mL的新鲜完整培养基;然后,将转染溶液添加到细胞中。在37°C下孵育孵化器中的细胞,CO2为5%。也可以按照制造商的说明使用不同于利菲他胺 2,000 的其他转染剂。
4. 转染后,加入7 mL的完整新鲜培养基3小时,然后,在37°C下进一步孵育细胞24-48小时,然后再进行下一次检测。转染后的第二天,用新鲜完整的介质替换介质。

4. 管形测定

1. 在 4°C 冷却 96 孔板和移液器吸头 1 小时,然后准备凝胶地下室。
2. 在地下室准备时,将板放在冰上(0°C),并在每口井中加入50μL的冷基质,同时避免气泡的形成。请注意,在手术过程中,含基质小瓶应保存在冰上,因为基质在室温下会变硬。
3. 将板置于 37°C 的培养箱中,在 5% CO₂下至少 30 分钟,使地下室聚合。
4. 同时,收获细胞。用 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA 溶液用 1 mL 清洗 HUVEC;然后,加入2 mL的胰蛋白酶-EDTA溶液,在37°C孵育5分钟。在倒置显微镜下观察细胞,验证细胞层是否完全分散。然后,收集细胞悬浮的介质,在264 x g离心下收获分离的细胞3分钟。将其悬浮在1mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
5. 要计算细胞,将0.2 mL的细胞悬浮液添加到0.5 mL的PBS和0.3 mL的0.4%锥蓝色溶液中。在室温下5分钟后,计算Bürker室中的细胞。
6. 以2 x10⁴细胞/50μL的浓度将细胞重新悬浮在完全培养基中。以每井2 x 10⁴个细胞的浓度将它们播种到凝胶基底上,并让它沉淀。
7. 注意细胞的数量。在凝胶地下室上,太多或太少的细胞可能无法以正确的方式形成管子。
8. 准备增加剂量RGWE(0.01,0.1和1毫克/mL),稀释培养基或鲁丁(12,120和300μg/mL)中的库存溶液,所有剂量均在50μL/孔的最终体积中,并加入50μL/孔细胞悬浮液。每口井的最终体积为100 μL。为每个实验条件准备四到六口井。作为一种控制,稀释蒸馏水(车辆)在培养基以1:50的比例。
9. 在37°C和5%CO2下孵育孵化器中的细胞,时间从6至24小时不等。
10. 种子播种后,使用相比显微镜以10倍的放大倍数观察6至24小时的时间范围内的细胞。HUVECs 能够在 6 小时内形成类似管的结构,但在 12 - 18 小时后可以观察到更好的结果。 拍摄每个井上的管状结构,并在每个井中平均显示 3 到 5 个随机场。
11. 图像采集后,细胞可以从基底基质分离并计数,以评估处理对细胞数量的影响。对于每口井,取出介质,在24 U/mL浓度下加入消生剂,并将板置于37°C1小时。然后,从每个井中收集细胞悬浮的介质,并在264 x g离心下收获分离的细胞3分钟。在0.2 mL的PBS中重新悬浮它们。要计算细胞,将0.2 mL的细胞悬浮液添加到0.5 mL的PBS和0.3 mL的0.4%锥蓝色溶液中。在室温下5分钟后,计算Bürker室中的细胞。
12. 为了量化管形成测定的结果,可以计算至少三个管连接的分支点的数量。使用适当的图像软件,计算每个显微图中每个字段的分支点数,并计算每个实验条件的标准误差 (SE) 平均值。使用双尾t检验来评估统计显著性。

结果

为了评估RGWE对血管生成的影响,我们对凝胶基底基体进行了管形成测定。在它上培养时,HUVECs形成类似管的结构,这些结构来自看似拉长的细胞,并相互连接,形成细胞网络(图2)。在图3中,我们发现使用RGWE处理的HUVEC中的分支数量与控制条件相比要低得多。值得注意的是,在0.1毫克/mL和1毫克/mL RGWE的情况下,与对照条件相比,分支的数量?...

讨论

天然化合物具有高化学多样性和生化特异性,是潜在治疗性分子的来源。在这里,我们展示如何从植物R.重兆中提取水提取物,并提出管形测定作为一种易于执行、可靠和定量的方法,可用于研究RGWE对血管生成的影响。务必将R.黄叶煮沸1小时,以确保获得完整的水萃取物。沸腾不到1小时不允许提取所有分子,提取物不能发挥预期的生物效应。

管形成测定代表一种体外测?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can