HUVEC Tube-Formation Assay zur Bewertung der Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese

Zusammenfassung

Hier evaluieren wir die Auswirkungen des Wasserextrakts von Ruta-Grabolen auf die Gefäßnetzbildung, indem wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix verwenden.

Zusammenfassung

Angiogenese ist ein Phänomen, das verschiedene Prozesse umfasst, wie endotheliale Zellproliferation, Differenzierung und Migration, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen und mehrere Signaltransduktionswege beinhalten. Hier zeigen wir, dass der Rohrbildungstest eine einfache In-vitro-Methode ist, um die Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese zu bewerten und die beteiligten molekularen Mechanismen zu untersuchen. Insbesondere sind Endothelzellen in Gegenwart des Wasserextrakts von Ruta graveolens (RGWE) nicht mehr in der Lage, ein Zellzellnetz zu bilden, und dass die RGWE-Wirkungen auf die Endothelzellbildung der menschlichen Nabelvene (HUVEC) durch die konstitutive Aktivierung von MEK.

Einleitung

Angiogenese ist ein physiologischer Prozess, der zur Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden führt und während der Embryogenese und des Organwachstums auftritt. Im Erwachsenenalter wird die Angiogenese nur im Radfahren des Eierstocks, in der Plazenta während der Schwangerschaft und während der Wundheilung und -reparatur aktiviert. Die Angiogenese hängt von der Fähigkeit der Endothelzellen ab, sich zu vermehren, zu differenzieren und zu einem intakten Gefäßnetz zu migrieren¹. Bei mehreren Erkrankungen, wie entzündlichen, metabolischen und rheumatischen Erkrankungen, werden angiogene Prozesse jedoch verändert und die Angiogenese wird exzessiv. Darüber hinaus stimulieren unkontrollierte angiogene Prozesse auch die Tumorprogression und Metastasierung¹. Aus diesen Gründen konzentrieren sich die Forschungsstudien in den letzten zehn Jahren auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Hemmung übermäßiger Angiogenese bei Krebs-, Augen-, Gelenk- oder Hauterkrankungen^2,3.

Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) stellt das Hauptziel der aktuellen antiangiogenen Therapien⁴dar, und mehrere monoklonale Antikörper gegen VEGF wurden entwickelt und synthetisiert, um eine übermäßige Angiogenese zu verhindern. Jedoch, Diese synthetischen Drogen zeigen schwere Nebenwirkungen und haben ein ungünstiges Kosten-Nutzen-Verhältnis^5,6. Daher ist es unerlässlich, neue therapeutische Strategien zu finden, um übermäßige Angiogenese mit minimalen Nebenwirkungen zu begrenzen, um mit derzeit verwendeten Medikamenten zu ergänzen und zu kombinieren. Diese neuen Medikamente finden sich unter natürlichen Produkten, die sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität auszeichnen.

In diesem Artikel schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Auswirkungen der RGWE auf die Fähigkeit von HUVECs zu bewerten, Tubuli auf einer gegelten Kellermatrix in vitro⁵zu bilden. In der Tat ist RGWE eine Mischung aus sekundären Metaboliten wie Flavonoiden und Polyphenolen, unter denen Rutin die Hauptkomponente ist⁵. Viele von ihnen wurden bereits als entzündungshemmende und vasoprotektive Mittel^7,8,9,10,11getestet. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass RGWE, aber nicht Rutin, in der Lage ist, die HUVEC-Fähigkeit, Tubulen auf einer gegelten Kellermatrix zu bilden, zu hemmen und dass dieses Phänomen durch den MEK-ERK-Weg vermittelt wird, was darauf hindeutet, dass RGWE ein mögliches therapeutisches Werkzeug ist, das in der Lage ist, übermäßige Bildung neuer Blutgefäße zu verhindern⁵.

Protokoll

1. RGWE Vorbereitung

1. Sammeln Sie R. graveolens Blätter von Pflanzen während der Frühlings-/Sommermonate unter der Aufsicht eines Botanikers.
   HINWEIS: In diesem Fall wurden Die Blätter in der Experimentellen Abteilung für Heilpflanzen im Botanischen Garten von Neapel, Italien⁵gesammelt. Die Pflanze ist spontan, mehrjährige, und ist in den Mittelmeerregionen vorhanden (Abbildung 1).
2. 250 g Blätter wiegen und mit einer Schere fein hacken.
3. Die Blätter in einen konischen Kolben geben und 1 L destilliertes Wasser zu 250 g gehackten Blättern geben und bei 110 °C 60 min zum Kochen bringen. Den Kolben mit Aluminiumfolie bedecken, um übermäßige Verdunstung zu vermeiden.
4. Verwenden Sie 3 mm-Trichterfilterpapier, um die gekochten Blätter von der flüssigen Phase zu trennen, die den Wasserextrakt darstellt.
5. Filtern Sie die Flüssigphase durch einen 0,22 m-Filter und sammeln Sie sie in einem Becher. Den Becher mit Parafilm bedecken und den Extrakt über Nacht bei -80 °C einfrieren.
6. Machen Sie 10 - 15 Löcher mit einer Nadel im Parafilm und lyophilisieren Sie den Extrakt in einem Lyophilisator. Beachten Sie, dass es ein paar Tage dauern kann, um das Pulver zu erhalten.
7. Wiegen Sie das erhaltene Pulver, teilen Sie es in Aliquots auf und lagern Sie es bei 4 °C, bis es notwendig ist. Es ist möglich, es für ein Jahr zu speichern.
8. Bei Bedarf für die Experimente eine Stammlösung vorbereiten, die das Pulver mit destilliertem Wasser auf eine Standardkonzentration von 50 mg/ml verdünnt. Trennen Sie es in kleine (z.B. 1 ml) Aliquots. Dieses Präparat kann bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden, kann aber aufgrund der Oxidationen der Moleküle nicht mehr als ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden. Vermeiden Sie Einfrieren und Tauen.

2. Zellkultur

1. Kultivieren Sie HUVECs im endothelialen Zellwachstumsmedium: endotheliale Basalmedium, ergänzt mit 1 g/ml Hydrocortison und 1 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 10% FBS, und Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%_CO2.
2. Wenn 80% konfluent, teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:3 jede Passage. Verwenden Sie Zellen von zwei bis fünf Passagen, die keine offensichtlichen Unterschiede in der Reaktion auf Wachstumsfaktoren zeigen. Nach dem sechsten Durchgang werden die Zellen seneszierend und bilden keine Schläuche auf der gegelten Kellermatrix.

3. Transfektion

1. Wenn die HUVECs zu 70% konfluent sind, transfekt sie mit dem gewünschten Gen.
2. Für eine 100-mm-Platte verwenden Sie 1 g leeren pCDNA3-Vektor als Kontrolle und 1 g pCDNA3-Vektor, der das betreffende Gen enthält (in diesem Fall konstitutiv aktives MEK [caMEK).
3. Komplexe DNA mit 3 l Lipofectamin 2.000, verdünnt mit reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle)bis zum Endvolumen von 200 l. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches, vollständiges Medium; fügen Sie dann die Transfecting-Lösung zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37°C, mit 5% CO2 . Es ist möglich, auch andere Transfektionsmittel zu verwenden, die sich von Lipofectamin 2.000 unterscheiden, nach den Anweisungen des Herstellers.
4. Fügen Sie 7 ml komplettes frisches Medium 3 h nach der Transfektion hinzu und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 °C für 24 - 48 h weiter, bevor Sie mit den nächsten Tests fortfahren. Ersetzen Sie am Tag nach der Transfektion das Medium durch ein frisches komplettes Medium.

4. Tube Formation Assay

1. Eine 96-Well-Platte und Pipettenspitzen bei 4 °C 1 H abkühlen, bevor Sie den gegelten Keller vorbereiten.
2. Zum Zeitpunkt der Kellervorbereitung die Platte auf Eis legen (0 °C) und in jedem Brunnen 50 l kalte Matrix hinzufügen, während die Bildung von Blasen vermieden wird. Beachten Sie, dass die matrixhaltige Durchstechflasche während des Verfahrens auf Eis gehalten werden sollte, da die Matrix bei Raumtemperatur fest wird.
3. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 für mindestens 30 min, damit der Keller polymerisieren kann.
4. In der Zwischenzeit ernten Sie die Zellen. Waschen Sie die HUVECs mit 1 ml einer 0,25% Trypsin/0,53 mM EDTA Lösung; Dann 2 ml der Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und bei 37 °C für 5 min inkubieren. Beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellschicht vollständig dispergiert ist. Dann sammeln Sie das Medium, in dem die Zellen suspendiert werden, und ernten Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 264 x g für 3 min. Setzen Sie sie in 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) aus.
5. Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 0,2 ml der Zellsuspension zu 0,5 ml PBS und 0,3 ml 0,4% Trypan-Blaulösung hinzu. Nach 5 min bei Raumtemperatur die Zellen in einer Bürker-Kammer zählen.
6. Setzen Sie die Zellen in vollständigem Medium in der Konzentration von 2 x 10⁴ Zellen/50 l aus. Samen Sie sie in der Konzentration von 2 x 10⁴ Zellen pro Brunnen in den gegelten Keller und lassen Sie sie sich darauf niederlassen.
7. Achten Sie auf die Anzahl der Zellen. Zu viele oder zu wenige Zellen bilden im gegelten Keller möglicherweise keine Schläuche auf die richtige Art und Weise.
8. Vorbereiten sie steigende Dosen von RGWE (0,01, 0,1 und 1 mg/ml), verdünnen Sie die Stammlösung in Kulturmedium oder Rutin (12, 120 und 300 g/ml), alles im Endvolumen von 50 l/well, und fügen Sie sie zu 50 l/Well der Zellsuspension hinzu. Das endige Volumen in jedem Brunnen beträgt 100 l. Bereiten Sie vier bis sechs Brunnen für jede experimentelle Bedingung vor. Als Kontrolle wird destilliertes Wasser (Fahrzeug) im Kulturmedium im Verhältnis 1:50 verdünnt.
9. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 für eine Zeit von 6 bis 24 h.
10. Beobachten Sie die Zellen innerhalb eines Zeitbereichs von 6 bis 24 h nach der Aussaat, mit einem Phasenkontrastmikroskop bei einer Vergrößerung von 10X. HUVECs sind in der Lage, röhrenartige Strukturen innerhalb von 6 h zu bilden, aber es ist möglich, bessere Ergebnisse nach 12 - 18 h zu beobachten. Fotografieren Sie die röhrenartigen Strukturen auf jedem Brunnen und stellen Sie einen Durchschnitt von drei bis fünf zufälligen Feldern in jedem Brunnen.
11. Nach der Bildaufnahme können die Zellen von der Kellermatrix gelöst und gezählt werden, um die Wirkung der Behandlung auf die Anzahl der Zellen zu bewerten. Für jeden Brunnen das Medium entfernen, Dispase bei einer Konzentration von 24 U/ml hinzufügen und die Platte 1 h bei 37 °C setzen. Dann, von jedem Brunnen, sammeln Sie das Medium, in dem die Zellen suspendiert werden und ernten Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 264 x g für 3 min. Resuspend sie in 0,2 ml PBS. Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 0,2 ml Zellsuspension zu 0,5 ml PBS und 0,3 ml 0,4% Trypan-Blaulösung hinzu. Nach 5 min bei Raumtemperatur die Zellen in der Bürkerkammer zählen.
12. Um die Ergebnisse des Rohrbildungstestes zu quantifizieren, ist es möglich, die Anzahl der Verzweigungspunkte zu zählen, in denen sich mindestens drei Röhren verbinden. Zählen Sie mit der entsprechenden Bildsoftware für jedes Feld in jedem Mikrograph die Anzahl der Verzweigungspunkte, und berechnen Sie den Mittelwert des Standardfehlers (Standardfehler, SE) für jede Versuchsbedingung. Verwenden Sie einen zweischwänzigen t-Test, um die statistische Signifikanz zu bewerten.

Ergebnisse

Um den Einfluss von RGWE auf die Angiogenese zu bewerten, führten wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix durch. Wenn sie darauf kultiviert werden, bilden HUVECs röhrenartige Strukturen, die aus Zellen stammen, die länsam erscheinen und sich zu einem Zell-Zell-Netzwerk verbinden (Abbildung 2). In Abbildung 3zeigen wir, dass die Anzahl der mit RGWE behandelten Filialen in HUVECs im Vergleich zu den Kontrollbedi...

Diskussion

Natürliche Verbindungen zeichnen sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität aus und stellen eine Quelle potenziell therapeutischer Moleküle dar. Hier zeigen wir, wie man Wasserextrakt aus der Pflanze R. graveolens erhält und schlagen den Rohrbildungstest als einfach durchzuführende, zuverlässige und quantitative Methode vor, die nützlich ist, um die Auswirkungen von RGWE auf die Angiogenese zu untersuchen. Es ist wichtig, die R. graveolens Blätter für 1 h zu kochen, um ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can