HuVEC Tube-formation D'essai pour évaluer l'impact des produits naturels sur l'angiogenèse

Résumé

Ici, nous évaluons les effets de l'extrait d'eau de Ruta graveolens sur la formation du réseau de navires en utilisant un essai de formation de tube sur une matrice de sous-sol gélifiée.

Résumé

L'angiogenèse est un phénomène qui comprend différents processus, tels que la prolifération des cellules endothéliales, la différenciation et la migration, qui conduisent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et impliquent plusieurs voies de transduction du signal. Ici, nous montrons que l'essai de formation de tube est une méthode in vitro simple pour évaluer l'impact des produits naturels sur l'angiogenèse et pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués. En particulier, en présence de l'extrait d'eau de Ruta graveolens (RGWE), les cellules endothéliales ne sont plus en mesure de former un réseau cellulaire et que les effets RGWE sur la formation de tubes de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont abolis par le l'activation constitutive de MEK.

Introduction

L'angiogenèse est un processus physiologique qui conduit à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux préexistants et se produit pendant l'embryogenèse et la croissance des organes. À l'âge adulte, l'angiogenèse n'est activée que dans l'ovaire cycliste, dans le placenta pendant la grossesse, et pendant la cicatrisation et la réparation des plaies. L'angiogenèse dépend de la capacité des cellules endothéliales à proliférer, différencier et migrer pour former un réseau vasculaire intact¹. Cependant, dans plusieurs désordres, tels que les maladies inflammatoires, métaboliques, et rhumatismales, les processus angiogéniques sont modifiés et l'angiogenèse devient excessive. En outre, les processus angiogéniques incontrôlés stimulent également la progression de tumeur et la métastasie^1. Pour ces raisons, au cours de la dernière décennie, les études de recherche sont axées sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à l'inhibition de l'angiogenèse excessive dans le cancer, oculaire, articulaire, ou les troubles de la peau^2,3.

Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) représente lacible principale des thérapies antiangiogenic actuelles 4, et plusieurs anticorps monoclonaux anti-VEGF ont été développés et synthétisés pour empêcher l'angiogenèse excessive. Cependant, ces drogues synthétiques montrent des effets secondaires graves et ont un rapport coût-bénéfice défavorable^5,6. Par conséquent, il est impératif de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter l'angiogenèse excessive avec des effets secondaires minimes pour compléter et combiner avec les médicaments actuellement utilisés. Ces nouveaux médicaments peuvent être trouvés parmi les produits naturels qui sont caractérisés par une grande diversité chimique et la spécificité biochimique.

Dans cet article, nous proposons une méthode simple pour évaluer l'impact de la RGWE sur la capacité des HUVECs à former des tubules sur une matrice de sous-sol gélifiée in vitro⁵. En effet, RGWE est un mélange de métabolites secondaires tels que les flavonoïdes et les polyphénols parmi lesquels la rutine est la principale composante⁵. Beaucoup d'entre eux ont déjà été testés comme agents anti-inflammatoires et vasoprotecteurs^7,8,9,10,11. En outre, nous avons récemment démontré que RGWE, mais pas rutin, est capable d'inhiber la capacité HUVEC de former des tubules sur une matrice de sous-sol gélifiéet et que ce phénomène est médié par la voie MEK-ERK, indiquant RGWE comme un outil thérapeutique potentiel capable de prévenir la formation excessive de nouveaux vaisseaux sanguins⁵.

Protocole

1. Préparation RGWE

1. Recueillir les feuilles de R. graveolens des plantes pendant les mois de printemps/été sous la supervision d'un botaniste.
   REMARQUE: Dans ce cas, les feuilles ont été recueillies à la Section expérimentale des plantes médicinales dans le Jardin botanique de Naples, Italie⁵. La plante est spontanée, vivace et est présente dans les régions méditerranéennes (figure 1).
2. Peser 250 g de feuilles et les hacher finement avec des ciseaux.
3. Mettre les feuilles dans un flacon conique et ajouter 1 L d'eau distillée à 250 g de feuilles hachées et porter à ébullition à 110 oC pendant 60 min. Couvrir le flacon de papier d'aluminium pour éviter une évaporation excessive.
4. Utilisez du papier filtre de 3 mm pour séparer les feuilles bouillies de la phase liquide qui représente l'extrait d'eau.
5. Filtrer la phase liquide à travers un filtre de 0,22 m, en le recueillant dans un bécher. Couvrir le bécher de parafilm et congeler l'extrait à -80 oC pendant la nuit.
6. Faire 10 - 15 trous avec une aiguille dans le parafilm et lyophiliser l'extrait dans un lyophilisateur. Notez qu'il peut prendre quelques jours pour obtenir la poudre.
7. Peser la poudre obtenue, la diviser en aliquots et la conserver à 4 oC jusqu'à ce que cela soit nécessaire. Il est possible de le stocker pendant un an.
8. Si nécessaire pour les expériences, préparer une solution de stock, diluer la poudre avec de l'eau distillée à une concentration standard de 50 mg/mL. Séparez-le en aliquots en petit volume (p. ex. 1 ml). Cette préparation peut être stockée à -20 oC jusqu'à ce qu'elle soit utilisée, mais ne peut pas être stockée à 4 oC pendant plus de deux jours en raison des oxydations des molécules. Évitez le gel et le dégel.

2. Culture cellulaire

1. Cultiver huVECs dans le milieu de croissance cellulaire endothéliale: milieu basal endothélial complété par 1 hydrocortisone g/mL et 1 ng/mL facteur de croissance épidermique, 10% FBS, et la pénicilline / streptomycine à 37 oC dans une atmosphère de 5% CO₂.
2. Lorsque 80% de confluents, diviser les cellules au rapport de 1:3 chaque passage. Utilisez des cellules de deux à cinq passages, qui ne montrent pas de différences apparentes en réponse aux facteurs de croissance. Après le sixième passage, les cellules deviennent sénescentes et ne forment pas de tubes sur la matrice du sous-sol gélifié.

3. Transfection

1. Lorsque les HUVEC sont confluents à 70 %, transfect-les avec le gène désiré.
2. Pour une plaque de 100 mm, utilisez 1 g de vecteur pCDNA3 vide comme vecteur de contrôle et 1 g de vecteur pCDNA3 contenant le gène d'intérêt (constitutivement actif MEK [caMEK], dans ce cas).
3. Complexe 1 g d'ADN avec 3 l de lipofectamine 2 000, dilué avec un milieu sérique réduit (voir Tableau des matériaux) au volume final de 200 l. Retirez le milieu des cellules et remplacez-le par 1 ml de milieu frais et complet; puis, ajoutez la solution de transfecting aux cellules. Incuber les cellules de l'incubateur à 37oC, avec 5 % de CO 2. Il est également possible d'utiliser d'autres agents de transfection différents de la lipofectamine 2 000, suivant les instructions du fabricant.
4. Ajouter 7 ml de milieu frais complet de 3 h après la transfection et, ensuite, incuber davantage les cellules à 37 oC pendant 24 à 48 h avant de procéder aux essais suivants. Le lendemain de la transfection, remplacer le milieu par un milieu frais et complet.

4. Essai de formation de tube

1. Refroidir une assiette de 96 puits et des pointes de pipette à 4 oC pour 1 h avant de préparer le sous-sol gélifié.
2. Au moment de la préparation du sous-sol, mettre la plaque sur la glace (0 oC) et ajouter 50 l de matrice froide dans chaque puits tout en évitant la formation de bulles. Notez que la fiole contenant la matrice doit être conservée sur la glace pendant la procédure puisque la matrice devient solide à température ambiante.
3. Mettre la plaque dans l'incubateur à 37 oC avec 5 % de CO₂ pendant au moins 30 min pour permettre au sous-sol de polymériser.
4. En attendant, récoltez les cellules. Laver les HUVEC avec 1 ml d'une solution EDTA de 0,25 % trypsine/0,53 mM; puis, ajouter 2 ml de la solution trypsine-EDTA et incuber à 37 oC pendant 5 min. Observez les cellules sous un microscope inversé pour vérifier que la couche cellulaire est complètement dispersée. Ensuite, recueillir le milieu dans lequel les cellules sont suspendues et récolter les cellules détachées par centrifugation à 264 x g pendant 3 min. Resuspendre dans 1 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS).
5. Pour compter les cellules, ajouter 0,2 ml de la suspension cellulaire à 0,5 ml de PBS et 0,3 ml de solution bleue trypan de 0,4 %. Après 5 min à température ambiante, compter les cellules dans une chambre de Bûrker.
6. Resuspendre les cellules dans un milieu complet à la concentration de 2 x 10⁴ cellules/50 l. Les ensemencer sur le sous-sol gélifié à la concentration de 2 x 10⁴ cellules par puits et les laisser s'y installer.
7. Faites attention au nombre de cellules. Trop ou trop peu de cellules peuvent ne pas former des tubes de la bonne façon sur le sous-sol gélifié.
8. Préparer des doses croissantes de RGWE (0,01, 0,1 et 1 mg/mL), diluer la solution de stock dans le milieu de culture ou la rutine (12, 120 et 300 g/mL), le tout dans le volume final de 50 l/puits, et les ajouter à 50 l/puits de suspension cellulaire. Le volume final dans chaque puits sera de 100 l. Préparer quatre à six puits pour chaque condition expérimentale. À titre de contrôle, diluer l'eau distillée (véhicule) dans le milieu de culture à un rapport de 1:50.
9. Incuber les cellules de l'incubateur à 37 oC et 5 % de CO₂ pendant une période allant de 6 à 24 h.
10. Observez les cellules dans une plage de temps s'étendant de 6 à 24 h après l'ensemencement, à l'aide d'un microscope à contraste de phase à un grossissement de 10X. Les HUVEC sont capables de former des structures tubulaires dans un rayon de 6 h, mais il est possible d'observer de meilleurs résultats après 12 à 18 h. Photographiez les structures tubulaires de chaque puits et imagez en moyenne de trois à cinq champs aléatoires dans chaque puits.
11. Après l'acquisition de l'image, les cellules peuvent être détachées de la matrice du sous-sol et comptées pour évaluer l'effet du traitement sur le nombre de cellules. Pour chaque puits, retirer le milieu, ajouter le dépase à une concentration de 24 U/mL, et mettre la plaque à 37 oC pendant 1 h. Puis, de chaque puits, recueillir le milieu dans lequel les cellules sont suspendues et récolter les cellules détachées par centrifugation à 264 x g pendant 3 min. Resuspendre dans 0,2 ml de PBS. Pour compter les cellules, ajouter 0,2 ml de suspension cellulaire à 0,5 ml de PBS et 0,3 ml de solution bleue trypan de 0,4 %. Après 5 min à température ambiante, compter les cellules dans la chambre de La ville.
12. Pour quantifier les résultats de l'essai de formation du tube, il est possible de compter le nombre de points de branche dans lesquels se rejoignent au moins trois tubes. À l'aide du logiciel d'image approprié, comptez pour chaque champ dans chaque micrographe le nombre de points de branche et calculez la moyenne - l'erreur standard (SE) pour chaque condition expérimentale. Utilisez un test tà deux queues pour évaluer la signification statistique.

Résultats

Pour évaluer l'influence de RGWE sur l'angiogenèse, nous avons effectué un essai de formation de tube sur une matrice gélifiée de sous-sol. Lorsqu'ils sont cultivés sur elle, huVECs forment des structures tubulaires qui proviennent de cellules qui semblent allongées et qui se connectent les uns les autres pour former un réseau cellulaire -cellule (Figure 2). Dans la figure 3, nous montrons que le nombre de branches dans l...

Discussion

Les composés naturels sont caractérisés par une grande diversité chimique et spécificité biochimique et représentent une source de molécules potentiellement thérapeutiques. Ici, nous montrons comment obtenir l'extrait d'eau de la plante R. graveolens et proposons l'essai de formation de tube comme méthode facile à exécuter, fiable, et quantitative utile pour étudier les effets de RGWE sur l'angiogenèse. Il est important de faire bouillir les feuilles de R. graveolens pendant 1 h pour être...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can