מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה

Summary

כאן, אנו להעריך את ההשפעות של תמצית המים של רוטה הקבר על היווצרות הרשת באמצעות שימוש בשיטת היווצרות צינור על מטריצה מרתף ג.

Abstract

אנגיוגנזה היא תופעה הכוללת תהליכים שונים, כגון הפצת תאים אנדותל, בידול והגירה, המובילה להקמת כלי דם חדשים ומערבת מספר מסלולים של אותות התמרה. כאן אנו מראים ששיטת היווצרות הצינורות היא דרך פשוטה להעריך את ההשפעה של מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה ולחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים. בפרט, בנוכחות תמצית המים של רוטה האלגני (rgwe), תאי האנדותל אינם מסוגלים עוד ליצור רשת תא תא וכי השפעות rgwe על תא הטבור האנושי (huvec) היווצרות שפופרת בוטלה על ידי ה הפעלה חוקתית של מק.

Introduction

אנגיוגנזה הוא תהליך פיזיולוגי המוביל להיווצרות כלי דם חדשים מקיימים ומתרחש במהלך צמיחת embryogenesis ואיברים. בבגרות, אנגיוגנזה מופעל רק בשחלה רכיבה על אופניים, השליה במהלך ההריון, במהלך ריפוי פצעים ותיקון. אנגיוגנזה תלוי ביכולת של תאי האנדותל להתרבות, להבדיל ולהגר ליצירת רשת כלי דם מלאה¹. עם זאת, במספר הפרעות, כגון מחלות דלקתיות, מטבולית ושגרונית, תהליכי אנגיוגנטיים משתנים ואנגיוגנזה הופך להיות מוגזם. יתר על כן, תהליכים אנגיוגנטית מבוקרת גם לעורר התקדמות הגידול גרורות¹. מסיבות אלה, בעשור האחרון, לימודי מחקר מתמקדים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות שמטרתן עיכוב של אנגיוגנזה מוגזם בסרטן, בעינית, במפרק, או בהפרעות בעור^2,3.

גורם הגדילה של כלי הדם (מהווה את המטרה העיקרית של הטיפולים הקיימים אנטי-אנגיוגנטיים⁴, ומספר נוגדנים אנטי-וסקולריים שפותחו ומסונתז כדי למנוע אנגיוגנזה מוגזם. עם זאת, תרופות סינתטי אלה להראות תופעות לוואי חמורות יש יחס שלילי לתועלת הרווח^5,6. לכן, זה הכרחי למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי להגביל אנגיוגנזה מוגזם עם תופעות לוואי מינימליות כדי להשלים ולשלב עם סמים המשמשים כיום. תרופות חדשות אלה ניתן למצוא בין מוצרים טבעיים המאופיינת מגוון כימי גבוה וספציפיות הביוכימי.

במאמר זה, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על היכולת של HUVECs ליצור tubules על מטריצה מרתף g, מבחנה⁵. אכן, rgwe הוא תערובת של מטבוליטים משני כגון פלאונואידים ו פוליפנולים ביניהם רוטין הוא המרכיב העיקרי⁵. רבים מהם נבדקו כבר כסוכנים אנטי דלקתיים ובעלי מצבר^7,8,9,¹⁰,¹¹. יתר על כן, לאחרונה הדגמנו כי rgwe, אבל לא rutin, הוא מסוגל לעכב את היכולת huvec ליצור tubules על מטריצה מרתף g, כי תופעה זו מתווכת על ידי מסלול מק-טיפשה, המציין rgwe ככלי טיפולי פוטנציאלי מסוגל ל למנוע היווצרות כלי דם חדש מוגזמת⁵.

Protocol

1. הכנת RGWE

1. במהלך חודשי האביב/הקיץ בפיקוחו של בוטניקאי יש לאסוף את העלים מצמחים.
   הערה: במקרה זה, העלים נאספו בסעיף ניסיוני של צמחי מרפא בגן הבוטני של נאפולי, איטליה⁵. המפעל הוא ספונטני, רב שנתי, והוא נוכח באזורים הים התיכון (איור 1).
2. שוקלים 250 גרם של עלים וקוצצים דק אותם עם מספריים.
3. לשים את העלים בבקבוקון חרוט ולהוסיף 1 L של מים מזוקקים כדי 250 גרם של עלים קצוצים ולהביא את זה לרתיחה ב 110 ° c עבור 60 דקות. לכסות את הבקבוקון עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אידוי מוגזם.
4. השתמש בנייר סינון של 3 מ"מ משפך כדי להפריד את העלים המבושלים משלב הנוזלים המייצג את תמצית המים.
5. לסנן את השלב הנוזלי באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר, לאסוף אותו בגביע. כסו את הגביע בעזרת parafilm והקפא את התמצית ב-80 ° c בלילה.
6. הפוך 10-15 חורים עם מחט בתוך הפראפilm וליאופליז בתמצית בליאופליזר. שים לב כי זה יכול לקחת כמה ימים כדי להשיג את האבקה.
7. שוקלים את האבקה שמתקבלת, מחלקים אותו לתוך הליברוטים, ומאחסנים אותה ב -4 ° צ' עד הצורך. ניתן לאחסן אותו במשך שנה.
8. בעת הצורך בניסויים, להכין פתרון מניות, לדלל את האבקה עם מים מזוקקים לריכוז רגיל של 50 mg/mL. הפרד אותו לנפח קטן (לדוגמה, 1 mL). הכנה זו יכולה להיות מאוחסנת ב-20 ° צ' עד לשימוש, אך לא ניתן לאחסנו ב-4 ° c במשך יותר מכמה ימים בגלל החמצן של המולקולות. הימנע הקפאה והפשרה.

2. תרבית תאים

1. לטפח HUVECs במדיום צמיחת תא אנדותל: המדיום הבסיס אנדותל שיושלם עם 1 μg/mL הידרוקורטיזון ו 1 ng/mL גורם צמיחה באפידרמיס, 10% FBS, ו פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° c באווירה של 5% CO₂.
2. כאשר 80% שוטפת, פצל את התאים ביחס של 1:3 בכל מעבר. השתמש בתאים משתיים עד חמישה מעברים, שאינם מראים הבדלים גלויים בתגובה לגורמי גדילה. לאחר המעבר השישי, התאים הופכים להיות שאינם יוצרים צינורות על מטריצת המרתף הגושית.

3. מעבר חצייה

1. כאשר HUVECs הם 70% confluent, מעביר אותם עם הגן הרצוי.
2. עבור צלחת 100 מ"מ, השתמש 1 μg של ריק pCDNA3 וקטור כמו שליטה 1 μg של pCDNA3 וקטור המכיל את הגן של עניין (מק פעיל באופן מכונן [caMEK], במקרה זה).
3. קומפלקס 1 μg של ה-DNA עם 3 μL של lipofectamine 2,000, מדולל בינוני סרום מופחת (ראה טבלת חומרים) לנפח הסופי של 200 μl. הסר את המדיום מן התאים ולהחליף אותו עם 1 מ ל של מדיום מלאה טריים; לאחר מכן, הוסף את פתרון ההעברה לתאים. דגירה את התאים בחממה ב 37 ° c, עם 5% CO₂. ניתן גם להשתמש בסוכני הlipofectamine אחרים שונים מ-2,000, בעקבות הוראות היצרן.
4. הוסף 7 מ ל של מדיום טרי מלאה 3 שעות לאחר הגלגול ולאחר מכן, לאחר מכן, מודצ נוסף את התאים ב 37 ° c עבור 24-48 h לפני שתמשיך עם assays הבא. יום לאחר החצייה, החליפו את המדיום במדיום מלאה ורעננה.

4. שיטת היווצרות הצינור

1. מגניב 96 צלחת לוחית ומצננים הצינורות ב 4 ° צ' עבור 1 h לפני הכנת מרתף ג.
2. ברגע של הכנת המרתף, לשים את הצלחת על הקרח (0 ° c) ולהוסיף 50 μL של מטריצה קרה בכל טוב תוך הימנעות היווצרות של בועות. שים לב כי המבחנה המכילה מטריקס יש לשמור על הקרח במהלך ההליך מאז המטריצה הופכת יציבה בטמפרטורת החדר.
3. שים את הצלחת בחממה ב 37 ° c עם 5% CO₂ עבור לפחות 30 דקות כדי לאפשר את המרתף כדי פולימלזציה.
4. . בינתיים, תקצור את התאים שטוף את HUVECs עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין/0.53 מ"מ פתרון EDTA; לאחר מכן, להוסיף 2 מ ל של הפתרון טריפסין-EDTA ו הדגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות. שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ הפוך כדי לוודא ששכבת התא מפוזרת לחלוטין. לאחר מכן, לאסוף את המדיום שבו התאים מושעה ולקצור את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה ב 264 x g עבור 3 דקות. להשעות אותם ב 1 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS).
5. כדי לספור את התאים, להוסיף 0.2 mL של ההשעיה התא ל 0.5 mL של PBS ו 0.3 mL של 0.4% טרי, פתרון כחול. לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, ספור את התאים בחדר בורקר.
6. להשעות את התאים בינוני מלא בריכוז של 2 x 10⁴ תאים/50 μl. Seed אותם על המרתף ג בריכוז של 2 x 10⁴ תאים לכל טוב ולתת להם ליישב על זה.
7. שים לב למספר התאים. רבים מדי או יותר מדי תאים לא יכול ליצור צינורות בדרך הנכונה במרתף ג.
8. להכין מינונים הגוברת של rgwe (0.01, 0.1, ו-1 מ"ג/mL), לדלל את פתרון המניה במדיום התרבות או רוטין (12, 120, ו300 μg/mL), הכל בנפח הסופי של 50 μl/ובכן, ולהוסיף אותם ל-50 μl/באר של השעיית תאים. הכרך האחרון בכל באר יהיה 100 μL. הכינו ארבע עד שש בארות. לכל מצב ניסיוני כפקד, לדלל מים מזוקקים (רכב) במדיום התרבות ביחס של 1:50.
9. דגירה את התאים בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור זמן הנע בין 6 אל 24 h.
10. שימו לב לתאים בטווח הזמן שבין 6 ל -24 שעות לאחר זריעה, תוך שימוש במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה בהגדלה של 10X. HUVECs מסוגלים ליצור מבנים כמו tube בתוך 6 h אבל זה אפשרי להתבונן תוצאות טובות יותר לאחר 12-18 h. לצלם את מבנים כמו צינור על כל היטב התמונה ממוצע בין שלושה עד חמישה שדות אקראיים בכל טוב.
11. לאחר רכישת התמונה, ניתן להתנתק מן התאים מתוך מטריצת המרתף ולבחון את השפעת הטיפול במספר התאים. עבור כל באר, להסיר את המדיום, להוסיף dispase בריכוז של 24 U/mL, ולשים את הצלחת ב 37 ° c עבור 1 h. אז, מכל באר, לאסוף את המדיום שבו התאים מושעה והקציר התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה ב 264 x g עבור 3 דקות. השהה אותם ב 0.2 ML של PBS. כדי לספור את התאים, להוסיף 0.2 mL של השעיית התא 0.5 mL של PBS ו 0.3 mL של 0.4% טרימין כחול פתרון. לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, ספור את התאים בחדר בורקר.
12. כדי לכמת את התוצאות של שיטת היווצרות הצינורית, ניתן לספור את מספר נקודות הסניף בהן לפחות שלוש שפופרות מצטרפות. באמצעות תוכנת התמונה המתאימה, לספור עבור כל שדה בכל מיקרוגרף את מספר נקודות הסתעפות ולחשב את הממוצע ± השגיאה הסטנדרטית (SE) עבור כל תנאי ניסיוני. השתמש במבחן דו -זנבי כדי להעריך משמעות סטטיסטית.

תוצאות

כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על אנגיוגנזה, בוצע שיטת היווצרות שפופרת על מטריצת מרתף מגולב. כאשר מטפחים אותו, HUVECs טופס מבנים כמו צינור שמקורם תאים המופיעים מוארך והמחברים זה את זה כדי ליצור רשת תא תא (איור 2). באיור 3, אנו מראים כי מספר הסניפים ב H...

Discussion

תרכובות טבעיות מתאפיינות בגיוון כימי גבוה ובחומרים ביוכימיים ומייצגים מקור למולקולות טיפוליות בפוטנציה. כאן, אנו מראים כיצד להשיג תמצית מים מהמפעל R. קברות ולהציע את שיטת היווצרות הצינור כשיטה קלה לביצוע, אמין, כמותית שימושי כדי לחקור את ההשפעות של rgwe על אנגיוגנזה. חשוב להרתיח את העל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can