Tubo HUVEC-ensaio de formação para avaliar o impacto dos produtos naturais na angiogênese

Resumo

Aqui, nós avaliamos os efeitos do extrato da água de Ruta graveolens na formação da rede do vaso usando um ensaio da formação do tubo em uma matriz gelada do porão.

Resumo

A angiogênese é um fenômeno que inclui diferentes processos, como proliferação de células endoteliais, diferenciação e migração, que levam à formação de novos vasos sanguíneos e envolvem várias vias de transdução de sinal. Aqui nós mostramos que o ensaio da formação do tubo é um método in vitro simples para avaliar o impacto de produtos naturais na angiogênese e para investigar os mecanismos moleculars envolvidos. Em particular, na presença do extrato de água de Ruta graveolens (rgwe), as células endoteliais já não são capazes de formar uma rede celular e que os efeitos rgwe na formação de tubos de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são abolidos pela ativação constitutiva do MEK.

Introdução

A angiogênese é um processo fisiológico que leva à formação de novos vasos sanguíneos de preexistentes e ocorre durante a embriogênese e o crescimento de órgãos. Na idade adulta, a angiogênese é ativada apenas no ovário cicatricial, na placenta durante a gravidez, e durante a cicatrização e reparo da ferida. A angiogênese depende da capacidade das células endoteliais de proliferarem, diferenciar e migrar para formar uma rede vascular intacta¹. No entanto, em vários distúrbios, como doenças inflamatórias, metabólicas e reumáticas, os processos angiogênicos são alterados e a angiogênese torna-se excessiva. Além disso, processos angiogênicos descontrolados também estimulam a progressão tumoral e a metástase¹. Por estas razões, na última década, os estudos de pesquisa estão focados no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a inibição da angiogênese excessiva no câncer, ocular, articular ou distúrbios cutâneos^2,3.

O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) representa o principal alvo das terapias antiangiogênicas atuais⁴, e vários anticorpos monoclonais anti-VEGF foram desenvolvidos e sintetizados para prevenir a angiogênese excessiva. No entanto, essas drogas sintéticas apresentam efeitos colaterais graves e têm uma relação custo-benefício desfavorável^5,6. Portanto, é imperativo encontrar novas estratégias terapêuticas para limitar a angiogênese excessiva com efeitos colaterais mínimos para complementar e combinar com drogas atualmente usadas. Estes novos fármacos podem ser encontrados entre os produtos naturais que se caracterizam por uma elevada diversidade química e especificidade bioquímica.

Neste artigo, propomos um método simples para avaliar o impacto do RGWE na capacidade de HUVECs de formar túbulos em uma matriz basal gelada in vitro⁵. Na verdade, RGWE é uma mistura de metabólitos secundários, como flavonoides e polifenóis, entre os quais a rutina é o principal componente⁵. Muitos deles já foram testados como agentes anti-inflamatórios e vasoprotetores^7,8,9,10,11. Além disso, temos demonstrado recentemente que RGWE, mas não rutina, é capaz de inibir a capacidade HUVEC para formar túbulos em uma matriz de porão gelada e que este fenômeno é mediado pela via MEK-ERK, indicando RGWE como uma ferramenta terapêutica potencial capaz de prevenir a formação excessiva de novos vasos sanguíneos⁵.

Protocolo

1. preparação RGWE

1. Colete as folhas de R. graveolens das plantas durante os meses da mola/verão a supervisão de um botânico.
   Nota: Neste caso, as folhas foram coletadas na seção experimental de plantas medicinais no jardim botânico de Nápoles, Itália⁵. A planta é espontânea, perene, e está presente nas regiões mediterrânicas (Figura 1).
2. Pesar 250 g de folhas e pique-os finamente com tesouras.
3. Coloque as folhas em um balão cônico e adicione 1 L de água destilada a 250 g de folhas picadas e leve-a a ferver a 110 ° c por 60 min. Cubra o balão com folha de alumínio para evitar a evaporação excessiva.
4. Use papel de filtro de funil de 3 mm para separar as folhas cozidas da fase líquida que representa o extrato de água.
5. Filtre a fase líquida através de um filtro de 0,22 μm, recolhendo-o num copo. Cubra o copo com parafilm e congele o extrato em-80 ° c durante a noite.
6. Faça 10-15 furos com uma agulha no parafilm e liofililize o extrato em um lyophilizer. Note que pode demorar um par de dias para obter o pó.
7. Pesar o pó obtido, dividi-lo em alíquotas, e armazená-lo a 4 ° c até que seja necessário. É possível armazená-lo por um ano.
8. Quando necessário para os experimentos, prepare uma solução de estoque, diluindo o pó com água destilada para uma concentração padrão de 50 mg/mL. Separe-o em pequenos volumes (por exemplo, 1 mL) de alíquotas. Esta preparação pode ser armazenada a-20 ° c até ser utilizada, mas não pode ser armazenada a 4 ° c por mais de um par de dias devido às oxidações das moléculas. Evite congelar e degelo.

2. cultura de células

1. Cultivar HUVECs em meio de crescimento de células endoteliais: meio basal endotelial suplementado com 1 μg/mL de hidrocortisona e 1 ng/mL de fator de crescimento epidérmico, 10% FBS e penicilina/estreptomicina a 37 ° c em uma atmosfera de 5% CO₂.
2. Quando 80% confluentes, dividir as células na proporção de 1:3 cada passagem. Use células de duas a cinco passagens, que não mostram diferenças aparentes em resposta a fatores de crescimento. Após a sexta passagem, as células tornam-se senescentes e não formam tubos na matriz gelada do porão.

3. transfecção

1. Quando os HUVECs são 70% confluentes, transfecção-los com o gene desejado.
2. Para uma placa de 100 mm, use 1 μg de vetor pCDNA3 vazio como controle e 1 μg de vetor pCDNA3 contendo o gene de interesse (MEK constitutivamente ativo [caMEK], neste caso).
3. Complexo 1 μg de DNA com 3 μL de lipofectamina 2.000, diluído com meio sérico reduzido (ver tabela de materiais) para o volume final de 200 μl. Retire o meio das células e substitua-o por 1 ml de meio completo fresco; em seguida, adicione a solução de transfecting às células. Incubar as células na incubadora a 37 ° c, com 5% CO₂. Também é possível utilizar outros agentes de transfecção diferentes da lipofectamina 2.000, seguindo as instruções do fabricante.
4. Adicionar 7 mL de meio fresco completo 3 h após a transfecção e, em seguida, incubar ainda mais as células a 37 ° c por 24-48 h antes de prosseguir com os próximos ensaios. No dia após o transfection, substitua o meio com o meio completo fresco.

4. ensaio de formação de tubos

1. Fixe uma placa 96-well e pontas da pipeta em 4 ° c para 1 h antes de preparar o porão gelificada.
2. No momento da preparação do porão, coloque a placa no gelo (0 ° c) e adicione 50 μL de matriz fria em cada poço, evitando a formação de bolhas. Observe que o frasco contendo matriz deve ser mantido no gelo durante o procedimento, uma vez que a matriz se torna sólida à temperatura ambiente.
3. Põr a placa na incubadora em 37 ° c com 5% CO₂ para pelo menos 30 minutos para permitir que o porão polimerize.
4. Enquanto isso, colha as celas. Lave os HUVECs com 1 mL de uma solução de EDTA 0,25% tripsina/0,53 mM; em seguida, adicione 2 mL da solução de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° c durante 5 min. Observe as células um microscópio invertido para verificar se a camada celular está completamente dispersa. Em seguida, recolher o meio em que as células são suspensas e colher as células destacadas por centrifugação em 264 x g por 3 min. ressuscitem-los em 1 ml de fosfato-tampão salina (PBS).
5. Para contar as células, adicione 0,2 ml da suspensão da célula a 0,5 ml de PBS e 0,3 ml de solução de azul de Tripan 0,4%. Após 5 minutos à temperatura ambiente, conte as células em uma câmara de Bürker.
6. Ressuscite as células em meio completo na concentração de 2 x 10⁴ células/50 μL. semente eles para o porão gelificada na concentração de 2 x 10⁴ células por poço e deixá-los resolver sobre ele.
7. Preste atenção ao número de células. Demasiados ou demasiado poucas pilhas não podem formar tubos na maneira direita no porão gelificada.
8. Prepare doses crescentes de RGWE (0, 1, 0,1 e 1 mg/mL), diluindo a solução de ações em meio de cultura ou Rutina (12, 120 e 300 μg/mL), tudo no volume final de 50 μL/bem, e adicioná-los a 50 μL/poço de suspensão celular. O volume final em cada poço será de 100 μL. Prepare quatro a seis poços para cada condição experimental. Como controle, diluir a água destilada (veículo) no meio de cultura em uma proporção de 1:50.
9. Incubar as células na incubadora a 37 ° c e 5% CO₂ por um tempo variando de 6 a 24 h.
10. Observe as células dentro de um intervalo de tempo que abrange de 6 a 24 h após a semeadura, usando um microscópio de contraste de fase em uma ampliação de 10X. HUVECs são capazes de formar tubo-como estruturas dentro de 6 h, mas é possível observar melhores resultados após 12-18 h. fotografar as estruturas de tubo-like em cada poço e imagem uma média de três a cinco campos aleatórios em cada poço.
11. Após a aquisição da imagem, as células podem ser separadas da matriz basal e contabilizadas para avaliar o efeito do tratamento no número de células. Para cada poço, retire o meio, adicione Dispase a uma concentração de 24 U/mL, e coloque a placa a 37 ° c por 1 h. Então, de cada poço, recolher o meio em que as células são suspensas e colher as células destacadas por centrifugação em 264 x g por 3 min. ressuscitem-los em 0,2 ml de PBS. Para contar as células, adicione 0,2 ml de suspensão celular a 0,5 ml de PBS e 0,3 ml de solução de azul de Tripan 0,4%. Após 5 minutos à temperatura ambiente, conte as células na câmara de Bürker.
12. Para quantificar os resultados do ensaio de formação de tubos, é possível contar o número de pontos de ramificação nos quais pelo menos três tubos se juntam. Usando o software de imagem apropriado, conte para cada campo em cada micrografo o número de pontos de ramificação e calcule a média ± o erro padrão (SE) para cada condição experimental. Use um teste tde duas caudas para avaliar a significância estatística.

Resultados

Para avaliar a influência de RGWE na angiogênese, realizou-se um ensaio de formação de tubos em uma matriz de porão gelada. Quando cultivada nele, HUVECs formam estruturas semelhantes a tubos que se originam de células que aparecem alongadas e que se conectam entre si para formar uma rede celular (Figura 2). Na Figura 3, mostramos que o número de filiais em HUVECs tratados com rgwe foi significativamente menor em relação...

Discussão

Os compostos naturais são caracterizados por uma elevada diversidade química e especificidade bioquímica e representam uma fonte de moléculas potencialmente terapêuticas. Aqui, mostramos como obter o extrato de água da planta R. graveolens e propor o ensaio de formação de tubos como um método fácil de executar, confiável e quantitativo, útil para investigar os efeitos do rgwe na angiogênese. É importante ferver as folhas do R. graveolens para 1 h para ser certo obter o extrato completo da ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can