HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

Resumen

Aquí, evaluamos los efectos del extracto de agua de Ruta graveolens en la formación de la red de recipientes mediante el uso de un ensayo de formación de tubos en una matriz de sótano gelizado.

Resumen

La angiogénesis es un fenómeno que incluye diferentes procesos, como la proliferación de células endoteliales, la diferenciación y la migración, que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos e implican varias vías de transducción de señales. Aquí mostramos que el ensayo de formación de tubos es un método in vitro simple para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis e investigar los mecanismos moleculares involucrados. En particular, en presencia del extracto de agua de Ruta graveolens (RGWE), las células endoteliales ya no son capaces de formar una red celular y que los efectos RGWE sobre la formación de tubos de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) son abolidos por la formación de tubos de células sociales humanas (HUVEC) activación constitutiva de MEK.

Introducción

La angiogénesis es un proceso fisiológico que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y se produce durante la embriogénesis y el crecimiento de órganos. En la edad adulta, la angiogénesis se activa sólo en el ovario de ciclismo, en la placenta durante el embarazo y durante la cicatrización y reparación de heridas. La angiogénesis depende de la capacidad de las células endotelialespara proliferar, diferenciar y migrar para formar una red vascular intacta 1. Sin embargo, en varios trastornos, como enfermedades inflamatorias, metabólicas y reumáticas, los procesos angiogénicos se alteran y la angiogénesis se vuelve excesiva. Además, los procesos angiogénicos no controlados también estimulan la progresión tumoral y la metástasis¹. Por estas razones, en la última década, los estudios de investigación se centran en el desarrollo de nuevasestrategias terapéuticas dirigidas a la inhibición de la angiogénesis excesiva en trastornos del cáncer, ocular, articular o cutáneo 2,^3.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) representa elobjetivo principal de las terapias antiangiogénicas actuales 4, y se han desarrollado y sintetizado varios anticuerpos monoclonales anti-VEGF para prevenir la angiogénesis excesiva. Sin embargo, estas drogas sintéticas muestran efectos secundarios graves y tienen una relación costo-beneficio desfavorable^5,6. Por lo tanto, es imperativo encontrar nuevas estrategias terapéuticas para limitar la angiogénesis excesiva con efectos secundarios mínimos para complementar y combinar con los fármacos utilizados actualmente. Estos nuevos fármacos se pueden encontrar entre los productos naturales que se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica.

En este artículo, proponemos un método sencillo para evaluar el impacto de la RGWE en la capacidad delos HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelificada in vitro 5. De hecho, RGWE es una mezcla de metabolitos secundarios como flavonoides y polifenoles entre los que la rutina es el componente principal^5. Muchos de ellos ya han sido probados como agentes antiinflamatorios y vasoprotectores^7,8,9,10,11. Además, recientemente hemos demostrado que RGWE, pero no la rutina, es capaz de inhibir la capacidad de HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelizada y que este fenómeno está mediado por la vía MEK-ERK, lo que indica RGWE como una herramienta terapéutica potencial capaz de evitar la formación excesiva de nuevos vasos sanguíneos⁵.

Protocolo

1. Preparación de RGWE

1. Recoger las hojas de R. graveolens de las plantas durante los meses de primavera/verano bajo la supervisión de un botánico.
   NOTA: En este caso, las hojas fueron recogidas en la Sección Experimental de Plantas Medicinales en el Jardín Botánico de Nápoles, Italia⁵. La planta es espontánea, perenne y está presente enlas regiones mediterráneas (Figura 1).
2. Pesar 250 g de hojas y picarlas finamente con tijeras.
3. Poner las hojas en un matraz cónico y añadir 1 L de agua destilada a 250 g de hojas picadas y llevarlas a ebullición a 110 oC durante 60 minutos.
4. Utilice papel de filtro de embudo de 3 mm para separar las hojas hervidas de la fase líquida que representa el extracto de agua.
5. Filtrar la fase líquida a través de un filtro de 0,22 m, recogiendo en un vaso de precipitados. Cubrir el vaso de precipitados con parafilm y congelar el extracto a -80 oC durante la noche.
6. Hacer 10 - 15 agujeros con una aguja en la parapelícula y liofilizar el extracto en un liofilizador. Tenga en cuenta que puede tomar un par de días para obtener el polvo.
7. Pesar el polvo obtenido, dividirlo en alícuotas, y almacenarlo a 4 oC hasta que sea necesario. Es posible almacenarlo durante un año.
8. Cuando sea necesario para los experimentos, preparar una solución en stock, diluyendo el polvo con agua destilada a una concentración estándar de 50 mg/ml. Sepárelo en alícuotas de pequeño volumen (por ejemplo, 1 ml). Esta preparación se puede almacenar a -20 oC hasta su uso, pero no se puede almacenar a 4 oC durante más de un par de días debido a las oxidaciones de las moléculas. Evite la congelación y el deshielo.

2. Cultivo celular

1. Cultivar los HUVEC en medio de crecimiento celular endotelial: medio basal endotelial complementado con hidrocortisona de 1 g/ml y factor de crecimiento epidérmico ng/ml, 10% FBS, y penicilina/estreptomicina a 37oC en una atmósfera de 5% CO_2.
2. Cuando el 80% de confluente, divida las celdas en la proporción de 1:3 cada pasaje. Utilice celdas de dos a cinco pasajes, que no muestren diferencias aparentes en respuesta a los factores de crecimiento. Después del sexto pasaje, las células se vuelven senescentes y no forman tubos en la matriz de sótano gelificada.

3. Transfección

1. Cuando los HUVEC son un 70% de confluentes, transfectarlos con el gen deseado.
2. Para una placa de 100 mm, utilice 1 g de vector pCDNA3 vacío como control y 1 g de vector pCDNA3 que contenga el gen de interés (mek constitutivamente activo [caMEK], en este caso).
3. Complejo de 1 g de ADN con 3 ml de lipofectamina 2.000, diluido con medio sérico reducido (ver Tabla de Materiales)al volumen final de 200 l. Retire el medio de las células y reemplácelo por 1 ml de medio fresco completo; luego, agregue la solución de transfectación a las células. Incubar las células de la incubadora a 37oC, con un 5% de CO2. También es posible utilizar otros agentes de transfección diferentes de lipofectamine 2,000, siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Añadir 7 ml de medio fresco completo 3 h después de la transfección y, a continuación, incubar las células a 37oC durante 24 - 48 h antes de proceder con los siguientes ensayos. Al día siguiente de la transfección, sustituya el medio por un medio fresco y completo.

4. Ensayo de formación de tubos

1. Enfríe una placa de 96 pocillos y puntas de pipeta a 4oC durante 1 h antes de preparar el sótano gelificado.
2. En el momento de la preparación del sótano, poner la placa en hielo (0 oC) y añadir 50 oL de matriz fría en cada pocal evitando la formación de burbujas. Tenga en cuenta que el vial que contiene matriz debe mantenerse en hielo durante el procedimiento, ya que la matriz se vuelve sólida a temperatura ambiente.
3. Colocar la placa en la incubadora a 37oC con 5% de_CO2 durante al menos 30 min para permitir que el sótano se polimerice.
4. Mientras tanto, cosecha las células. Lavar los HUVEC con 1 ml de una solución EDTA de 0,25% trypsin/0.53 mM; luego, añadir 2 ml de la solución de trippsina-EDTA e incubar a 37 oC durante 5 min. Observe las células bajo un microscopio invertido para verificar que la capa celular está completamente dispersa. A continuación, recoger el medio en el que se suspenden las células y cosechar las células separadas por centrifugación a 264 x g durante 3 min. Resuspenderlas en 1 ml de solución salina con fosfato (PBS).
5. Para contar las celdas, agregue 0,2 ml de la suspensión celular a 0,5 ml de PBS y 0,3 ml de solución de color azul trypan al 0,4%. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, cuente las células en una cámara de B.rker.
6. Resuspenda las células en medio completo a la concentración de 2 x 10⁴ células/50 ol. Siembre en el sótano gelizado a la concentración de 2 x 10⁴ células por pozo y déjelas asentarse en él.
7. Preste atención al número de celdas. Demasiadas o muy pocas células pueden no formar tubos de la manera correcta en el sótano gelifilado.
8. Preparar las dosis crecientes de RGWE (0,01, 0,1 y 1 mg/ml), diluir la solución de stock en medio de cultivo o rutina (12, 120 y 300 g/ml), todo en el volumen final de 50 l/pozo, y añadirlos a 50 l/pozo de suspensión celular. El volumen final en cada pozo será de 100 l. Prepare de cuatro a seis pozos para cada condición experimental. Como control, diluir el agua destilada (vehículo) en el medio de cultivo en una proporción de 1:50.
9. Incubar las células de la incubadora a 37oC y 5% de_CO2 durante un tiempo que oscila entre 6 y 24 h.
10. Observe las células dentro de un rango de tiempo que se extiende de 6 a 24 h después de la sembración, utilizando un microscopio de contraste de fase con un aumento de 10X. Los HUVEC son capaces de formar estructuras similares a tubos dentro de 6 h, pero es posible observar mejores resultados después de 12 - 18 h. Fotografiar las estructuras similares a tubos en cada pozo e imaginar un promedio de tres a cinco campos aleatorios en cada pozo.
11. Después de la adquisición de la imagen, las células se pueden separar de la matriz del sótano y contar para evaluar el efecto del tratamiento en el número de células. Para cada poca, retire el medio, añada la dispensa ción a una concentración de 24 U/ml y coloque la placa a 37oC durante 1 h. Luego, de cada poca, recoger el medio en el que se suspenden las células y cosechar las células separadas por centrifugación a 264 x g durante 3 min. Resuspenderlas en 0,2 ml de PBS. Para contar las celdas, agregue 0,2 ml de suspensión celular a 0,5 ml de PBS y 0,3 ml de solución azul trypan al 0,4%. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, cuente las células en la cámara de B.rker.
12. Para cuantificar los resultados del ensayo de formación de tubos, es posible contar el número de puntos de bifurcación en los que se unen al menos tres tubos. Usando el software de imagen apropiado, cuente para cada campo en cada micrográfico el número de puntos de bifurcación y calcule la media del error estándar (SE) para cada condición experimental. Utilice una prueba tde dos colas para evaluar la significancia estadística.

Resultados

Para evaluar la influencia de RGWE en la angiogénesis, llevamos a cabo un ensayo de formación de tubos sobre una matriz de sótano gelificada. Cuando se cultivan en él, los HUVEC forman estructuras similares a tubos que se originan a partir de células que aparecen alargadas y que se conectan entre sí para formar una red de células celulares (Figura2). En la Figura3, mostramos que el número de sucursales en LOS HUVEC tratad...

Discusión

Los compuestos naturales se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica y representan una fuente de moléculas potencialmente terapéuticas. Aquí, mostramos cómo obtener extracto de agua de la planta R. graveolens y proponemos el ensayo de formación de tubos como un método fácil de realizar, confiable y cuantitativo útil para investigar los efectos de RGWE en la angiogénesis. Es importante hervir las hojas de R. graveolens durante 1 h para asegurarse de obtener el ex...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can