HUVEC трубообразования Анализ для оценки воздействия натуральных продуктов на ангиогенез

Резюме

Здесь мы оцениваем влияние экстракта воды Рута graveolens на формирование сети судов с помощью трубки формирования асссировки на гелеобразной матрицы подвала.

Аннотация

Ангиогенез является явление, которое включает в себя различные процессы, такие как пролиферация эндотелиальных клеток, дифференциация и миграция, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включают в себя несколько путей трансдукции сигнала. Здесь мы показываем, что анализ формирования трубки является простым методом in vitro для оценки влияния натуральных продуктов на ангиогенез и для исследования молекулярных механизмов. В частности, в присутствии экстракта воды Рута graveolens (RGWE), эндотелиальные клетки больше не в состоянии сформировать сеть клеток и что RGWE воздействие на человека пупочной вены эндотелиальной клетки (HUVEC) образование трубки отменяется составной активации МЭК.

Введение

Ангиогенез является физиологическим процессом, который приводит к образованию новых кровеносных сосудов из уже существующих и происходит во время эмбриогенеза и роста органов. В зрелом возрасте ангиогенез активируется только в велосипедных яичниках, в плаценте во время беременности, а также во время заживления ран и ремонта. Ангиогенез зависит от способности эндотелиальных клеток размножаться, дифференцироваться и мигрировать, образуя нетронутую сосудистую сеть^1. Однако при некоторых нарушениях, таких как воспалительные, метаболические и ревматические заболевания, изменяются ангиогенные процессы и становится чрезмерным ангиогенез. Кроме того, неконтролируемые ангиогенные процессытакже стимулируют прогрессирование опухоли и метастазирование 1. По этим причинам, в последнее десятилетие, исследования сосредоточены на разработке новых терапевтических стратегий, направленных на ингибирование чрезмерного ангиогенеза при раке, глазной, суставной или кожных заболеваний^2,3.

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) представляет собой основную цельтекущей антиангиогенной терапии 4, и несколько анти-VEGF моноклональных антител были разработаны и синтезированы для предотвращения чрезмерного ангиогенеза. Тем не менее, эти синтетические наркотики показывают серьезные побочные эффекты и имеют неблагоприятное соотношение затрат на выгоду^5,6. Поэтому крайне важно найти новые терапевтические стратегии, чтобы ограничить чрезмерный ангиогенез с минимальными побочными эффектами, чтобы дополнить и в сочетании с в настоящее время используется наркотиков. Эти новые препараты можно найти среди натуральных продуктов, которые характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической спецификой.

В этой статье мы предлагаем простой метод для оценки влияния RGWE на способность HUVECs формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала in vitro⁵. Действительно, RGWE представляет собой смесь вторичных метаболитов, таких как флавоноиды и полифенолы, среди которых колея является основным компонентом⁵. Многие из них уже протестированы как противовоспалительные и вазопротекторные средства^7,8,^9,10,11. Кроме того, мы недавно показали, что RGWE, но не rutin, способен подавлять способность HUVEC формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала и что это явление опосредовано meK-ERK путь, указывая RGWE в качестве потенциального терапевтического инструмента, способного предотвратить чрезмерное образование новых кровеносных сосудов⁵.

протокол

1. Подготовка РГВЕ

1. Соберите Листья R. graveolens из растений в течение весенне-летних месяцев под наблюдением ботаника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, листья были собраны в экспериментальной секции лекарственных растений в Ботаническом саду Неаполя, Италия⁵. Растение спонтанное, многолетнее, и присутствует в средиземноморских регионах(рисунок 1).
2. Взвесить 250 г листьев и мелко нарезать их ножницами.
3. Положите листья в коническую колбу и добавить 1 л дистиллированной воды до 250 г нарезанных листьев и довести это до кипения при температуре 110 градусов по Цельсию в течение 60 минут. Накройте колбу алюминиевой фольгой, чтобы избежать чрезмерного испарения.
4. Используйте фильтровальную бумагу 3 мм, чтобы отделить отварные листья от жидкой фазы, представляющей экстракт воды.
5. Фильтр жидкой фазы через фильтр 0,22 мкм, собирая его в стакан. Обложка стакан с parafilm и заморозить экстракт на -80 градусов по Цельсию в одночасье.
6. Сделайте 10 - 15 отверстий с помощью иглы в парафильме и лиофилизируют экстракт в лиофилизаторе. Обратите внимание, что это может занять несколько дней, чтобы получить порошок.
7. Взвесьте полученный порошок, разделите его на aliquots и храните его при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока это необходимо. Его можно хранить в течение года.
8. При необходимости для экспериментов приготовьте бульонный раствор, разбавляя порошок дистиллированной водой до стандартной концентрации 50 мг/мл. Разделите его на малообъемные (например, 1 мл) аликвоты. Этот препарат может храниться при -20 градусов до использования, но не может храниться при 4 градусах Цельсия в течение более чем нескольких дней из-за окисления молекул. Избегайте замерзнуть и оттепели.

2. Культура клеток

1. Культивировать HUVECs в эндотелиальной среде роста клеток: эндотелиальная базальная среда дополнена 1 мкг/мл гидрокортизона и 1 нг/мл эпидермального фактора роста, 10% FBS, и пенициллин / стрептомицин при 37 градусах по Цельсию в атмосфере 5% CO₂.
2. Когда 80% слияния, разделить клетки в соотношении 1:3 каждый проход. Используйте клетки от двух до пяти проходов, которые не показывают явных различий в ответ на факторы роста. После шестого прохода клетки становятся старческими и не образуют трубки на гелеобразной подвальной матрице.

3. Трансфекция

1. Когда HUVECs являются 70% слияния, трансфектируют их с желаемым геном.
2. Для 100-мм пластины используйте 1 мкг пустого вектора pCDNA3 в качестве контроля и 1 мкг вектора pCDNA3, содержащего ген интереса (в данном случае, в обязательно мята активных MEK (caMEK).
3. Комплекс 1 мкг ДНК с 3 л липофектамина 2000, разбавленный пониженной сывороточкой средой (см. Таблица Материалов) до конечного объема 200 Л. Удалить среду из клеток и заменить его 1 мл свежей полной среды; затем добавьте трансфектирующее раствор в клетки. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусахЦельсия, с 5% CO 2. Можно также использовать другие трансфекционные агенты отличаются от липофектамина 2000, следуя инструкциям производителя.
4. Добавьте 7 мл полной свежей среды 3 ч после трансфекции, а затем, дальнейшее инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 - 48 ч, прежде чем приступить к следующему анализу. На следующий день после трансфекции замените среду свежей полной средой.

4. Труба Формирование Ассай

1. Охладите 96-ну хорошую тарелку и пипетку советы на 4 КК в течение 1 ч, прежде чем готовить гелеобразный подвал.
2. В момент подготовки подвала, положить пластину на лед (0 градусов по Цельсию) и добавить 50 qL холодной матрицы в каждом колодце, избегая образования пузырьков. Обратите внимание, что матричная флакон должна храниться на льду во время процедуры, так как матрица становится твердой при комнатной температуре.
3. Положите пластину в инкубатор на 37 градусов с 5% CO 2, по крайней мере 30 минут, чтобы подвал полимеризации.
4. В то же время, урожай клеток. Вымойте HUVECs с 1 мл раствора 0,25% трипсина/0,53 мм EDTA; Затем добавьте 2 мл раствора трипсин-ЭДТА и инкубировать при 37 градусах По 5 мин. Наблюдайте за клетками под перевернутым микроскопом, чтобы убедиться, что клеточный слой полностью рассеян. Затем соберите среду, в которой клетки подвешены, и соберите отдельные клетки центрифугированием при 264 х г в течение 3 мин. Переприостановите их в 1 мл фосфатно-буферного солевой раствора (PBS).
5. Чтобы подсчитать клетки, добавьте 0,2 мл клеточной подвески до 0,5 мл PBS и 0,3 мл 0,4% пробана синего раствора. После 5 минут при комнатной температуре посчитайте клетки в камере Бюркера.
6. Resuspend клетки в полной среде в концентрации 2 х 10⁴ клетки /50 ЗЛ. Семя их на гелеобразный подвал в концентрации 2 х 10⁴ клетки в хорошо, и пусть они оседают на нем.
7. Обратите внимание на количество клеток. Слишком много или слишком мало клеток не может образовывать трубки в правильном направлении на гелеобразном подвале.
8. Приготовьте увеличивающиеся дозы RGWE (0,01, 0,1 и 1 мг/мл), разбавляя запасной раствор в культуре среднего или колютина (12, 120 и 300 мкг/мл), все в конечном объеме 50 л/ну, и добавьте их к 50 л/хорошо клеточной подвески. Окончательный объем в каждой скважине будет 100 л. Подготовьте от четырех до шести скважин для каждого экспериментального состояния. В качестве контроля разбавляют дистиллированную воду (транспортное средство) в культурной среде в соотношении 1:50.
9. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение времени в диапазоне от 6 до 24 ч.
10. Наблюдайте за клетками в пределах временной дальности, охватывающей от 6 до 24 ч после посева, используя фазовый контрастный микроскоп при увеличении 10X. HUVECs способны формировать трубчатые структуры в пределах 6 ч, но можно наблюдать лучшие результаты после 12 - 18 ч. Фотография трубчатых структур на каждом колодце и изображение в среднем от трех до пяти случайных полей в каждом колодце.
11. После получения изображения клетки можно отсоединить от матрицы подвала и посчитать, чтобы оценить влияние лечения на количество клеток. Для каждого колодца удалите средство, добавьте диспазу в концентрации 24 U/mL и положите тарелку при 37 градусах по Цельсию на 1 ч. Затем, из каждой скважины, соберите среду, в которой клетки подвешены и собирают отдельные клетки центрифугированием при 264 х г в течение 3 мин. Отрежь их в 0,2 мл PBS. Чтобы подсчитать клетки, добавьте 0,2 мл клеточной суспензии до 0,5 мл PBS и 0,3 мл 0,4% пробана синего раствора. После 5 минут при комнатной температуре подсчитайте клетки в камере Бюркера.
12. Для количественной оценки результатов исследования формирования трубки можно подсчитать количество ветких точек, в которые соединяются не менее трех трубок. Используя соответствующее программное обеспечение изображения, подсчитайте для каждого поля в каждом микрографе количество точек ветки и вычислите среднее значение стандартной ошибки (SE) для каждого экспериментального состояния. Используйте двуххвостый t-тест для оценки статистической значимости.

Результаты

Чтобы оценить влияние RGWE на ангиогенез, мы провели анализ формирования трубки на гелеобразной матрице подвала. При культивировании на нем, HUVECs форме трубки, как структуры, которые происходят из клеток, которые появляются удлиненные и которые соединяют друг с другом, ч?...

Обсуждение

Природные соединения характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической специфичностью и представляют собой источник потенциально терапевтических молекул. Здесь мы покажем, как получить экстракт воды из завода R. graveolens и предлагаем исследование образования трубк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can