HUVEC 튜브 형성 분석은 혈관 신생에 천연 물의 영향을 평가하기 위해

요약

여기서, 우리는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석을 사용하여 혈관 네트워크 형성에 루타 graveolens의 물 추출물의 효과를 평가한다.

초록

혈관 신생은 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 몇몇 신호 전광 통로를 관련시키는 내피 세포 증식, 분화 및 이동과 같은 다른 프로세스를 포함하는 현상입니다. 여기에서 우리는 관 형성 분석이 혈관 신생에 천연물의 충격을 평가하고 관련시킨 분자 기계장치를 조사하기 위하여 간단한 시험관 내 방법이다는 것을 보여줍니다. 특히, 루타 자갈렌즈(RGWE)의 물 추출물이 존재할 때, 내피 세포는 더 이상 세포 세포를 형성할 수 없으며 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 튜브 형성에 대한 RGWE 효과가 폐지되는 데에는 MEK의 구성 활성화.

서문

혈관 신생은 기존의 혈관에서 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 배아 발생 및 기관 성장 도중 생기는 생리적인 프로세스입니다. 성인기에서 혈관 신생은 사이클링 난소, 임신 중 태반, 상처 치유 및 수리 중에만 활성화됩니다. 혈관 신생은 내피 세포가 증식, 분화 및 이동하는 능력에 따라 달라지며 그대로 혈관네트워크를 형성합니다 1. 그러나 염증성, 대사 성 및 류마티스 질환과 같은 여러 장애에서 혈관 신생 과정이 변경되고 혈관 신생이 과도해집니다. 더욱이, 통제되지 않는 혈관신생 프로세스는 또한 종양진행 및 전이를 자극합니다 1. 이러한 이유로, 지난 10년간, 연구연구는 암, 안구, 관절 또는 피부 질환에서 과도한 혈관신생의 억제를 목표로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 초점을 맞추고^있다2,^3.

혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 현재 항혈관신생 요법 4의 주요표적을 나타내며, 과도한 혈관신생을 방지하기 위해 여러 개의 항-VEGF 단일클론 항체가 개발 및 합성되고 있다. 그러나, 이러한 합성 약물은 심각한 부작용을 보이고 불리한 비용대 이익 비율을 가지고 5,^6. 따라서, 보완하고 현재 사용되는 약물과 결합하는 최소한의 부작용으로 과도한 혈관 신생을 제한하는 새로운 치료 전략을 찾는 것이 필수적이다. 이러한 새로운 약물은 높은 화학적 다양성과 생화학적 특이성을 특징으로하는 천연 제품 중에서 찾을 수 있습니다.

이 문서에서는, 우리는 시험관에서 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브를 형성하는 HUVECs의 능력에 RGWE의영향을 평가하는 간단한 방법을 제안한다 5. 실제로, RGWE는 루틴이 주요^성분인가운데 플라보노이드 및 폴리페놀과 같은 이차 대사산물의 혼합물이다. 그들 중 많은 사람들이 이미 항 염증 및 혈관 보호 제 7,^8,9,^10,11로테스트되었습니다. 더욱이, 우리는 최근에 RGWE, 그러나 루틴이 아니라, 겔화된 지하 매트릭스에 관을 형성하는 HUVEC 능력을 억제할 수 있고 이 현상이 MEK-ERK 통로에 의해 중재된다는 것을, RGWE를 잠재적인 치료 도구로 나타낼 수 있다는 것을 증명했습니다 과도 한 새로운 혈관 형성을 방지⁵.

프로토콜

1. RGWE 준비

1. 식물학자의 감독 하에 봄/여름 철에 식물에서 R. graveolens 잎을 수집합니다.
   참고: 이 경우, 잎은 나폴리 식물원에서 약용 식물의 실험 섹션에서 수집되었다, 이탈리아^5. 식물은 자발적이고 다년생이며 지중해 지역에 존재합니다(그림1).
2. 잎 250g의 무게와 가위로 잘게 자릅니다.
3. 원추형 플라스크에 잎을 넣고 다진 잎 250g에 증류수 1L를 넣고 110 °C에서 60 분 동안 끓이십시오.
4. 3mm 깔때기 필터 용지를 사용하여 끓인 잎을 물 추출물을 나타내는 액체 상에서 분리합니다.
5. 0.22 μm 필터를 통해 액체 상을 걸쳐 비커에 수집합니다. 비커를 파라필름으로 덮고 추출물을 밤새 -80°C에서 동결시되.
6. 파라 필름에 바늘로 10 - 15 구멍을 만들고 동독에서 추출물을 동독화하십시오. 분말을 얻기 위해 며칠이 걸릴 수 있습니다.
7. 얻어진 분말을 계량하고, 알리쿼트으로 나누고, 필요할 때까지 4°C에 보관하십시오. 1 년 동안 보관 할 수 있습니다.
8. 실험에 필요한 경우, 50 mg/mL의 표준 농도로 증류수로 분말을 희석, 재고 용액을 준비합니다. 작은 볼륨 (예를 들어, 1 mL) aliquots로 분리합니다. 이 제제는 사용될 때까지 -20°C에서 보관될 수 있지만 분자의 산화로 인해 며칠 이상 4°C에서 보관할 수 없다. 동결 및 해동을 피하십시오.

2. 세포 배양

1. 내피 세포 성장 배지에서 HUVECs를 육성: 내피 기저 배지 1 μg/mL 하이드로 코르티손 과 1 ng/mL 표피 성장 인자, 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO2의 분위기에서 보충하였다.
2. 때 80% 결합, 의 비율로 세포를 분할 1:3 모든 통로. 성장 인자에 대한 반응에서 명백한 차이를 보이지 않는 2 ~ 5 개의 대구에서 세포를 사용하십시오. 여섯 번째 통로 후, 세포는 노화가되고 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브를 형성하지 않습니다.

3. 감염

1. HUVECs가 70 % 수렴되면 원하는 유전자로 트랜스 펙트하십시오.
2. 100 mm 플레이트의 경우, 관심 있는 유전자를 포함하는 1 μg의 pCDNA3 벡터와 1 μg의 빈 pCDNA3 벡터를 사용한다(이 경우, 구성적으로 활성 MEK[caMEK])).
3. 3 μL의 리포펙타민 2,000의 DNA의 복합체, 감소된 혈청 배지로 희석 (재료표참조) 최종 부피 200 μL. 세포에서 배지를 제거하고 신선한 완전한 배지의 1 mL로 대체; 그런 다음 셀에 트랜스펙팅 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 인큐베이터에서 세포를 배양하고 5% CO2로 배양합니다. 또한 제조 업체의 지침에 따라 lipofectamine 2,000에서 다른 다른 형질 감염 에이전트를 사용할 수 있습니다.
4. 완전한 신선한 배지 의 7 mL를 첨가 3 시간 후, 다음 애혈술을 진행하기 전에 24 - 48 시간 동안 37 °C에서 세포를 추가로 배양한다. 형질전환 다음날, 매질을 신선한 완전한 매체로 교체하십시오.

4. 튜브 형성 분석

1. 겔화 된 지하실을 준비하기 전에 96 웰 플레이트 및 피펫 팁을 4 °C에서 1 시간 동안 냉각시.
2. 지하 준비의 순간에, 얼음 (0 °C)에 접시를 넣고 거품의 형성을 피하면서 각 우물에 차가운 매트릭스 의 50 μL을 추가합니다. 매트릭스가 실온에서 고체가 되기 때문에 매트릭스 함유 바이알은 절차 중에 얼음위에 보관되어야 합니다.
3. 플레이트를 37°C에서 5% CO2로 30분 이상 동안 인큐베이터에 넣고 지하가 중합되도록 한다.
4. 그 동안, 세포를 수확. HUVECs를 0.25% 트립신/0.53 mM EDTA 용액의 1 mL로 세척; 그런 다음 트립신-EDTA 용액 2 mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 세포가 현탁되는 배지를 수집하고 3분 동안 264 x g에서 원심분리에 의해 분리된 세포를 수확한다.
5. 세포를 계산하기 위해, 0.2 mL의 세포 현탁액을 PBS의 0.5 mL및 0.3 mL의 0.4% 트라이판 블루 용액에 추가한다. 실온에서 5 분 후, 뷔르커 챔버에서 세포를 계산합니다.
6. 2 x 10^{4 세포} / 50 μL의 농도로 완전한 배지로 세포를 다시 일시 중단하십시오.
7. 셀 수에주의하십시오. 너무 많거나 너무 적은 세포는 겔화 된 지하실에 올바른 방법으로 튜브를 형성하지 않을 수 있습니다.
8. RGWE (0.01, 0.1 및 1 mg /mL)의 증가 복용량을 준비하고 배양 배지 또는 루틴 (12, 120 및 300 μg / mL)에서 재고 용액을 희석하고 최종 부피 50 μL / well에 추가하고 50 μL / well의 세포 현탁액을 추가하십시오. 각 웰의 최종 부피는 100 μL이 될 것입니다. 각 실험 조건에 대해 4~6개의 우물을 준비합니다. 대조군으로서, 배양 배지내의 증류수(vehicle)를 1:50의 비율로 희석시켰다.
9. 6~ 24시간 범위의 시간 동안 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
10. 10배의 배율로 위상 대비 현미경을 사용하여 시딩 후 6~24시간 범위 내에서 세포를 관찰합니다. HUVECs는 6 시간 이내에 튜브와 같은 구조를 형성 할 수 있지만 12 - 18 시간 후에 더 나은 결과를 관찰 할 수 있습니다.
11. 영상 획득 후, 세포는 지하 매트릭스로부터 분리될 수 있고 세포 수에 대한 치료의 효과를 평가하기 위해 카운트될 수 있다. 각 우물에 대해 배지를 제거하고 24 U/mL의 농도로 디스파스를 추가하고 플레이트를 37 °C에서 1 시간 동안 넣습니다. 이어서, 각각의 우물로부터, 세포가 부유되는 배지를 수집하고 3 분 동안 264 x g에서 원심분리에 의해 분리 된 세포를 수확. PBS의 0.2 mL에서 다시 중단. 세포를 계산하려면 0.2 mL의 세포 현탁액을 PBS의 0.5 mL에 추가하고 0.3 mL의 0.4% 트라이판 블루 용액을 추가합니다. 실온에서 5 분 후, 뷔르커 챔버의 세포를 계산합니다.
12. 튜브 형성 분석의 결과를 정량화하기 위해, 적어도 3개의 튜브가 결합되는 분기 점의 수를 카운트할 수 있다. 적절한 이미지 소프트웨어를 사용하여, 각 현미경의 각 필드에 대해 분기 점의 수를 계산하고 각 실험 조건에 대한 평균 ± 표준 오차(SE)를 계산한다. 두 꼬리 t-검정을 사용하여 통계적 유의를 평가합니다.

결과

혈관 신생에 대한 RGWE의 영향을 평가하기 위해 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석기를 실시했습니다. 그것에 경작될 때, HUVECs는 길쭉하게 보이고 세포 세포 네트워크를 형성하기 위하여 서로 연결되는 세포에서유래하는 관 같이 구조물을 형성합니다 (그림 2). 도3에서는 RGWE로 처리된 HUVECs의 분기 수가 대조군 조건에 비해...

토론

천연 화합물은 높은 화학적 다양성 및 생화학적 특이성을 특징으로 하며 잠재적으로 치료 분자의 공급원을 나타낸다. 여기서, 우리는 식물 R. graveolens에서 물 추출물을 얻는 방법을 보여주고 혈관 형성 분석법을 수행하기 쉽고 신뢰할 수 있으며 혈관 신생에 대한 RGWE의 효과를 조사하는 데 유용한 정량적 방법으로 제안합니다. 완전한 물 추출물을 얻으려면 R. graveolens 잎을 1 시간 동안...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HUVEC cells	Clontech	C2519A
FBS	Invitrogen	10270106
EBM-2 basal medium	Clontech	cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors	clontech	cc4147
Matrigel	Corning	354234
96-well plates	Thermo Scientific	167008
15 mL conical tubes	Sarstedt	62,554,502
10 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,254,001
5 mL disposable serological pipette	Sarstedt	861,253,001
1,000 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
100 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
20 μL pipette	Gilson	Pipetman classic
p1000 pipette tips	Sarstedt
p20-200 pipette tips	Sarstedt	70,760,502
Burker chamber	Fortuna
Trypan blu stain	Gibco	15250-061
DPBS	Gibco	14190-094
mill-ex 0.22 μm filters	Millipore	SLGS033SS
Lyophilizer	VirTis-SP Scientific
Incubator	Thermo Scientific
CO2	AirCos
Pen-Strep	Gibco	15070-063
100 mm dish	Sarstedt	833,902
pcDNA3	Invitrogen	v79020
Lipofectamine-2000	Invitrogen	11668027
Opti-MEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143-50G
Axiovert 25 microscope	Zeiss
AmScope MD500 camera	AmScope
Dispase	Thermo Scientific	D4818
Lab heater	Falc
ParaFilm	American National Can