بذر وغرس الاختلاس الرغامى السكروز هندسة الأنسجة في طراز الماوس

Summary

تضيق الفساد يشكل عقبة حاسمة في استبدال الأنسجة المهندسة مجرى الهواء. للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تضيق، نستخدم نموذج موريني لاستبدال الأنسجة المهندسة الرغامى مع الخلايا وحيدات النوى المبذورة نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات). هنا، نحن التفصيل لدينا البروتوكول، بما في ذلك تصنيع السقالة BM-الشركات متعددة الجنسيات العزلة والبذر الاختلاس، وغرس.

Abstract

خيارات العلاج للعيوب الخلقية أو الثانوي قطعة طويلة الرغامى تاريخيا محدودة بسبب عدم قدرة على استبدال أنسجة وظيفية. هندسة الأنسجة يحمل وعدا كبيرا كحل محتمل مع قدرته على دمج الخلايا والجزيئات الإشارات في سقالة ثلاثي الأبعاد. عمل مؤخرا مع ترقيع الأنسجة المهندسة القصبة الهوائية (تيتجس) وقد شهد بعض النجاح ولكن ترجمتها كان محدودا بالاختلاس تضيق graft انهيار وتأخر ابيثيلياليزيشن. من أجل التحقيق في آليات القيادة في هذه القضايا، قمنا بتطوير نموذج ماوس لزرع الأنسجة المهندسة الاختلاس الرغامى. وشيدت تيتجس باستخدام اليكتروسبون البوليمرات البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) والبولي يوريثان (PU) في خليط من الحيوانات الأليفة والبلوتونيوم (20:80 نسبة الوزن). كانت تبذر السقالات ثم استخدام خلايا النخاع وحيدات النوى معزولة من الأسبوع 6-8-الفئران C57BL/6 القديم بالتدرج في استخدام الطرد المركزي. 10 مليون من الخلايا الواحدة والاختلاس المصنفة على التجويف السقالة ويسمح لاحتضان بين عشية وضحاها قبل غرس بين الحلقات الثالثة والسابعة الرغامى. كانت قادرة على تلخيص نتائج تضيق هذه الطعوم وتأخر ابيثيلياليزيشن كما يتبين من التحليل النسيجي ونقص الكيراتين 5 و 14 الكيراتين القاعدية الخلايا الظهارية في الفلورة. هذا النموذج سيكون بمثابة أداة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تشارك في استضافة يعيد البناء.

Introduction

يمكن أن يقدم العيوب الرغامى طويل-الجزء كالشروط الخلقية النادرة مثل حلقات القصبة الهوائية كاملة و agenesis الرغامى، فضلا عن الصدمات النفسية، وخبيثة والعدوى. عندما يتجاوز 6 سم في 30% من طول القصبة الهوائية في الأطفال أو الكبار، لا يمكن أن تعامل هذه العيوب التعمير الجراحية. محاولات لاستبدال مجرى الهواء بنسيج ذاتي وزرع المأخوذة بنيات مصطنعة ابتليت بعدوى مزمنة وتحبيب والاعطال الميكانيكية، وتضيق.

ترقيع الأنسجة المهندسة القصبة الهوائية (تيتجس) يمكن أن يحتمل أن تعالج هذه المشاكل مع تجنب الحاجة للكبت المناعي مدى الحياة. في العقد الماضي، تم اختبارها في نماذج حيوانية وتستخدم سريرياً في حالات نادرة من استخدام الرأفة^1،،من²³تيتجس. في الدراسات الحيوانية السريرية والكبيرة على حد سواء، يتطلب الشفاء بعد العمليات الجراحية من الأنسجة المهندسة مجرى الهواء استبدال العديد من التدخلات لمكافحة تضيق (يعرف > تضييق لومينال 50%)، والحفاظ على مجرى الهواء سالكيه. عمل إضافي تيتج سعت إلى تخفيض هذا التضيق من خلال تقييم دور خلية بذر خيار والأوعية الدموية وتصميم سقالة. خلية بذر الخيارات وتصميم سقالة تهدف إلى استعادة هيكل/الدالة الأصلية القصبة الهوائية تركزت أساسا على الخلايا الظهارية التنفسية و chondrocytes المصنف على السقالات ريسوربابل وغير ريسوربابل وديسيلولاريزيد المختلفة. كما الأوعية الدموية المحتمل يلعب دوراً رئيسيا في التنمية لتضيق، ركزت المجموعات الأخرى على النحو الأمثل في المختبر أو نماذج هيتيروتوبيك للتعجيل بعودة التوعي أو نيوانجيوجينيسيس⁴. ومع ذلك، تحقيق الأوعية الدموية الناجحة مع أيضا الحفاظ على تيتج ميكانيكيا المختصة والفنية لا يزال يشكل تحديا. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تقليل تضيق يظل عقبة حاسمة لترجمة السريرية.

للتحقيق في هذه الاستجابة نسيجية إلى تيتج غرس في فيفو، قمنا بتطوير نموذج الأغنام لاستبدال الأنسجة المهندسة الرغامى. وتألفت الاختلاس مختلطة البولي ايثلين (الحيوانات الأليفة) والبولي يوريثان سقالة اليكتروسبون (PU) المصنف مع الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظم (بي أم-الشركات المتعددة الجنسيات). في هذا الفوج الصغيرة، أظهرنا أن BM ذاتي المبذورة-الشركات المتعددة الجنسيات التعجيل بإعادة ابيثيلياليزيشن وتأخر تضيق⁵. على الرغم من أن البذر مع بقاء BM-الشركات المتعددة الجنسيات تحسين ذاتي، الآلية الخلوية التي تعدل BM-الشركات المتعددة الجنسيات تشكيل نيوتيسوي الوظيفية لا يزال غير واضح.

التحقيق بشأن وضع نموذج مورين من الأنسجة المطلوبة المستوى الخلوية المهندسة استبدال القصبة الهوائية. مماثلة للدراسة الأغنام، علينا الاستفادة من سقالة اليكتروسبون PET:PU المصنف مع بي أم-الشركات المتعددة الجنسيات-تمشيا مع النموذج الأغنام، وتضيق تيتج نمواً على مدى الأسبوعين الأولين بعد غرس^{1،2،3 ،5}. هذا يشير إلى أن نموذج مورين لخص الباثولوجيا لوحظ سابقا، مما مكننا من مواصلة استجواب الآليات الخلوية الكامنة وراء تضيق مجرى الهواء.

في هذا التقرير، نحن التفصيل لدينا بروتوكول لهندسة الأنسجة استبدال القصبة الهوائية في طراز الماوس بما في ذلك تصنيع السقالة والعزلة BM-الشركات متعددة الجنسيات والاختلاس بذر وغرس (الشكل 1و الشكل 2).

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مستشفى "الأطفال على الصعيد الوطني".

1-سقالة التصنيع

1. إعداد حل بوليمر سلائف نانوفيبير من: 1) حل 8 wt % الحيوانات الأليفة في 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورويسوبروبانول، وتدفئة الحل إلى 60 درجة مئوية وب 2) يذوب و 3% بو في 1,1,1,3,3,3-هيكسافلورويسوبروبانول في درجة حرارة الغرفة.
2. عندما يبرد، الجمع بين الحلول لخلق خليط بوليمر نهائي من الحيوانات الأليفة والبلوتونيوم (20:80).
3. اليكتروسبين محلول PET+ بو على قضيب من فولاذ المقاوم للصدأ (1 مم) استخدام إبرة نصيحة كليلة 20 غراما في 60 مل حقنه مليئة بالحل PET:PU استخدام مجموعة إمدادات طاقة العاصمة الفولت عالي إلى + 14 كيلوفولت في الإبرة، الطاقة DC الفولت العالي آخر توريد مجموعة إلى-3 كيلو فولت ، بمعدل تدفق 5 مل/ساعة، وعلى مسافة 20 سم تلميح إلى الركيزة. قم بتدوير قضيب 350 لفة في الدقيقة خلال ترسب الألياف.
4. تستمر اليكتروسبينينج حتى يتحقق سمك الجدار سقالة المرجوة من 300 ميكرون. الشريحة السقالة قبالة القضيب، ثم أنه عقد تحت الفراغ بين عشية وضحاها إزالة أي المذيبات المتبقية.
5. تعقيم سقالة استخدام جرعة خفيفة الأشعة فوق البنفسجية من 350 مللي جول/سم² قبل غرس.

2-حصاد الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات)

1. Euthanize من 6-8 أسابيع الماوس القديمة، أنثى، C57BL/6 مع مزيج من الكيتامين (200 مغ/كغ)، إكسيلازيني (20 مغ/كغ) وكيتوبروفين (10 مغ/كغ). البحث عن القتل الرحيم كاملة بأسلوب قرصه الذيل. تأكد من اتباع مبادئ توجيهية محلية للقتل الرحيم.
2. تحت ظروف معقمة، إزالة الجلد على قصبة وتيبياس لفضح العظام باستخدام مقص جيد والملقط الصغير-أدزون. استخدام الملقط دومون #5 والملقط دومون #5/45 لإزالة اللفافة والاوتار. فصل العظام وقطع كل واحد منهم على كلا طرفي. استخدام المحاقن 5 مل وابرة ز 25، تدفق نخاع العظام في طبق بتري يحتوي على 30 مل من معهد ميموريال بارك Rosewell (ربمي) وسائل الإعلام. تصفية هذا ربمي مع نخاع العظام عن طريق 70 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة في أنبوب 50 مل.
3. في خزانة السلامة الأحيائية، ضع 5 مل دياتريزواتي بوليسوركروسي والصوديوم في أنبوب 15 مل. إضافة ربمي التي تحتوي على خلايا نخاع العظام وحيدات النوى أسفل الجانب من الأنبوب لتفادي الخلط بين الطبقتين بلطف. أجهزة الطرد المركزي في 461 x ز لمدة 30 دقيقة مع "الفرامل 1" في 24 درجة مئوية.
   ملاحظة: على لدينا أجهزة الطرد المركزي، تشغيل الفرامل 1 يقف لأطول وقت خلال التباطؤ.
4. من أصل ثلاث طبقات تشكلت، تجاهل الطبقة العليا (الوردي) من البلازما وجمع الطبقة الوسطى (واضحة) تتكون من الخلايا وحيدات النوى نخاع العظام. تجاهل متسرعا خلايا الدم الحمراء.
5. تمييع الخلايا وحيدات النوى نخاع العظم (بي أم-الشركات متعددة الجنسيات) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 1:1 وأجهزة الطرد المركزي في 461 x ز لمدة 10 دقائق مع الفرامل "9" في 24 درجة مئوية.
6. إزالة المادة طافية وتمييع بيليه مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 461 x ز لمدة 10 دقائق مع "الفرامل 9" في 24 درجة مئوية.
7. إزالة المادة طافية وتمييع بيليه مع ~ 10 مل ربمي.
8. تمييع 10 ميليلتر من الحل BM-الشركات متعددة الجنسيات مع حجم متساوية من 0.4% تريبان الأزرق في أنبوب 1 مل. المكان 10 ميليلتر من الحل في خلية العد الشريحة الدائرة. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية. كرر الخطوة وحساب متوسط عدد الخلايا.
   ملاحظة: تم الحصول على حصيلة متوسط خلية من الخلايا 1 × 10⁸ من استخدام اثنين من الفئران المانحين. هذا سيكون معادلاً لقصبة اثنين، وهما تيبياس أن نخاع العظام معزولة من.
9. الطرد المركزي الحل BM-الشركات متعددة الجنسيات في 461 x ز لمدة 10 دقائق مع "الفرامل 9" في 24 درجة مئوية. إزالة المادة طافية وتخفف من تركيز خلية إلى خلايا⁷ 10/الاختلاس.
   ملاحظة: لقد درس البذر الكفاءة بين 1 و 10 و 100 مليون من الخلايا ووجد أن الخلايا 10 مليون كل الابتزاز غلة أعلى كفاءة بذر.

3-خلية البذر في الطعوم

1. قياس أطوال السقالات وإذا لزم الأمر، قطع منها بطول 5 ملم.
2. قبل الرطب السقالة مع 5 ميليلتر من ربمي لأدنى 5 إزالة ربمي.
3. إضافة 5 ميليلتر من الحل BM-الشركات متعددة الجنسيات إلى التجويف سقالة لمدة 10 دقائق.
4. تمرير إبرة ز 21 من خلال التجويف الاختلاس واحتضان الفساد في 1000 ميليلتر من ربمي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة.

4-الكسب غير المشروع غرس

ملاحظة: ينبغي الحرص على الحفاظ على تقنية معقمة أثناء إجراء زرع الفساد.

1. استخدام الفئران C57BL/6 الإناث البالغ من العمر 6-8 أسبوع كمتلقين ترقيع خلايا المصنف. حقن انروفلوكساسين (10 مغ/كغ) 24 ساعة قبل الجراحة وقبل شق تحت الجلد.
2. وزن الماوس وإدارة جرعة 0.1 مل/10 غرام كوكتيل مخدر الكيتامين (100 مغ/كغ)، إكسيلازيني (10 مغ/كغ) وكيتوبروفين (5 مغ/كغ) التسكين إينترابيريتونيلي.
3. تحقق إذا كانت طائرة التخدير قد تحقق بالأسلوب قرصه الذيل. في تأكيد مستوى التخدير، تنطبق مرهم العيون عقيمة للعيون وقص الشعر على موقع الجراحية من الذقن إلى ترقوة. ضع الحيوان على لوح في موقف راقد الظهرية. تطهير الموقع الجراحي باستخدام أول وسادة بوفيدون الإعدادية، تليها منصة الإعدادية الكحول (الكحول 70%)، ومرة أخرى منصة الإعدادية بوفيدون.
4. وضع الحيوان تحت مجهر تشريح رأسه بعيداً عن الجراح. جعل شق خط الوسط تتراوح ترقوة عظم اللاوي بالمساعدة من غرامة المقص والملقط الصغير-أدزون. تنظيف اللفافة مع دومون #5 والملقط غرامة دومون #7، جنبا إلى جنب مع مسحه القطن معقمة إذا لزم الأمر، وإدراج ضام Colibri الاحتفاظ الذاتي.
5. فتح عضلات حزام (الشكل 3أ) مع الملقط غرامة دومون #5 و 7 # دومون للكشف عن غضروف الغدة الدرقية والغضاريف cricoid والقصبة الهوائية. صراحة فصل القصبة الهوائية من أعصاب الحنجرة المتكررة مواز على جانبي، يليه فصل كفافى من القصبة الهوائية من المريء (الشكل 3ب).
6. باستخدام إبرة 20 غ وعلامة الجراحية، وصمة عار في الجزء الأمامي من القصبة الهوائية.
7. تحديد القصبة الهوائية وجعل شق أدناه الحلقة الثالثة غضروف الرغامى وقطاع القصبة الهوائية باستخدام مقص ربيع فانس-توبنجن وزوج من الملقط غرامة دومون #7. عقد مع الملقط المنحنية الجميلة، تأمين القصبة الهوائية القاصي على القص باستخدام معقم خياطة نايلون 9-0 لإنشاء القصبة الهوائية مؤقتة (الشكل 3ج). ملاحظة: هو مادة خياطة بديلة التي يمكن استخدامها PDS 9-0 لريبروكسيميشن العضلات وزرع القصبة الهوائية.
8. مع إبرة 20 غ وعلامة جراحية، وصمة عار الفساد تمثل الجزء الأمامي.
9. زرع الفساد إدراج الدانية-الخلفي، الدانية الجانبية وغرامة خيوط الدانية الأمامي، بهذا الترتيب دومون #7 9-0 نايلون معقمة خياطة (الشكل 3د)، باستخدام الملقط وحامل إبرة.
10. تشغيل 180° الحيوان مكان ذيله بعيداً عن الجراح. الإفراج عن القصبة الهوائية مؤقتة. القصبة الهوائية القاصي هو غير كامل بحف للسماح باستخدام الجزء ريسيكتيد كَجِذْعِ في تراجع. عندما لم تعد هناك حاجة، يتم إزالة الجزء القصبة الهوائية 5 ملم تماما.
11. إكمال ملامسة البعيدة عن طريق وضع في خياطة الجروح بطريقة مماثلة كملامسة الدانية.
12. إعادة تقريب موقف الاختلاس وعضلات حزام. إغلاق شق استخدام خيوط النايلون العقيمة 9-0 في نمط قيد تشغيل.
13. حقن 0.1 مل البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) تحت الجلد ووضع الحيوان في قفص انتعاش على وسادة تدفئة دون غيرها من الحيوانات في القفص.
14. ملاحظة الماوس حتى أنها واعية وقادرة على أمبولاتي، ثم نقل الماوس إلى قفص جديد مع الفراش لينة ورطبة تشاو والماء العلاج (آيبوبروفين، 30 ملغ/كغ) من أجل ح 48. وبعد هذه الفترة الزمنية، العودة الماوس إلى قفص عادي مع الفئران الأخرى.
    ملاحظة: الفئران أن الحفاظ على الضائقة التنفسية أو انخفاض النشاط بعد زرع يتم مراقبتها من قبل موظفي المختبر و/أو الحيوانات في حاضنة 32 درجة مئوية. إذا استمرت المشكلة لأكثر من 48 ساعة، وينبغي أن يكون euthanized الفئران.

5-علم الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري

ملاحظة: توضع وويوزين البقع أجريت باستخدام تقنية معيارية من "صميم مورفولوجيا مستشفى" للأطفال على الصعيد الوطني. Immunohistochemistry قد أنجز وفقا للخطوات أدناه.

1. ديبارافينيزي الشرائح باستخدام 1) زيلين نفط لمدة 5 دقائق، زيلين نفط 2) لمدة 5 دقائق، 3) 100 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق، الإيثانول 4) 90% لمدة 5 دقائق، الإيثانول 5) 70% لمدة 5 دقائق، 6) المقطر ح₂س (dH₂س) لمدة 5 دقائق.
2. غمر الشرائح الموجودة في المخزن المؤقت لسترات ووضعه في طنجرة الضغط مملوءة بالمياه. الحرارة لمدة 10 دقائق ثم السماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة. غسل مع ألبومين المصل البقري 0.1% في برنامج تلفزيوني (جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقيقة شطف مع dH₂o.
   ملاحظة: يمكن أن يتم تدفئة أيضا مع حمام الماء الساخن أو الميكروويف لمدة 15 دقيقة.
3. احتضان الشرائح مع مصل الماعز العادي 3% في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة. أغسل مع 0.1% جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 5 احتضانها في جسم الأولية مع تركيزات كيراتين 5 (1: 1000)⁶وكيراتين 14 (1: 250)⁶ و F4/80 (1: 100)⁷ لح 18 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. يغسل مع 0.1% جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقائق كل غسل. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة بتركيز 1: 500 K5/K14 ورافعة F4/80 ح 1 في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع 0.1% جيش صرب البوسنة-برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 10 دقائق كل غسل.
5. التحميل باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينوليندولي (DAPI) التي تحتوي على كشوف تغطية وسائل الإعلام والزجاج المتصاعدة. السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.

النتائج

ويبين الشكل 1 تخطيطي تيتج بذر وغرس. وكان حصادها من الفئران C57BL/6 نخاع العظام ومثقف في المختبر. BM-الشركات المتعددة الجنسيات كانت معزولة بسبب كثافة استخدام الطرد المركزي والمصنفة على تيتج. تم زرع تيتجس المصنف في ماوس المتلقية C57BL/6 سينجينيك.

Discussion

من الضروري تطوير نموذج الماوس للأنسجة المهندسة تراتشيس في فهم العوامل التي حدت من الترجمة السريرية من تيتجس؛ إلا وهي انهيار الاختلاس وتضيق وتأخر ابيثيلياليزيشن⁴. عدد قليل من العوامل التي تسهم في هذه القيود تشمل اختيار المواد الاختلاس، وعملية التصنيع، وتصميم سقالة وخلية الب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20