Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Transplantat Stenose stellt eine kritische Hindernis Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz. Um zellulären Mechanismen, die Stenose zu untersuchen, verwenden wir ein Mausmodell entwickelt trachealen Gewebeersatz mit kernigen Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC). Hier zeigen wir unsere Protokoll, einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation.

Zusammenfassung

Behandlungsmöglichkeiten bei angeborenen oder sekundäre langes Segment trachealen Mängel wurden historisch beschränkt aufgrund einer Unfähigkeit, funktionale Gewebe ersetzen. Gewebetechnik hält großes Versprechen als eine mögliche Lösung mit seiner Fähigkeit, Zellen und Signalmoleküle in eine 3-dimensionale Gerüst zu integrieren. Neuere Arbeiten mit Gewebezüchtungen trachealen Transplantationen (TETGs) hat einige Erfolge gesehen, aber ihre Übersetzung von Transplantat Stenose begrenzt, Transplantat Zusammenbruch und Epithelisierung verzögert. Um die Mechanismen fahren diese Fragen zu untersuchen, haben wir ein Mausmodell für Gewebezüchtungen trachealen Graft Implantation entwickelt. TETGs wurden unter Verwendung Electrospun Polymere Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU) in einer Mischung aus PET und PU (20: 80 Prozent Gewicht) konstruiert. Gerüste wurden dann ausgesät mit Knochenmark mononukleären Zellen isoliert von 6-8 Wochen-alte C57BL/6 Mäusen durch gradient zentrifugieren. 10 Millionen Zellen pro Graft waren auf das Lumen des Gerüstes ausgesät und erlaubt über Nacht vor der Implantation zwischen dem dritten und siebten trachealen Ringe auszubrüten. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der Stenose zu rekapitulieren und Epithelisierung verzögert, wie histologische Analyse und Mangel an Keratin 5 und Keratin 14 basalen Epithelzellen auf Immunfluoreszenz zeigen. Dieses Modell dient als Instrument für die Untersuchung von zellulärer und molekularer Mechanismen Host Umgestaltung beteiligt.

Einleitung

Long-Segment trachealen Mängel können als seltene angeborene Erkrankungen wie komplette trachealen Ringe und trachealen Agenesie sowie Trauma, Bösartigkeit und Infektion darstellen. Bei Überschreitung von 6 cm bei Erwachsenen oder 30 % der trachealen Länge bei Kindern können diese Mängel durch chirurgische Rekonstruktion behandelt werden. Versuche, die Atemwege mit Eigengewebe, cadaveric Transplantationen und künstliche Konstrukte zu ersetzen haben chronische Infektion, Granulation, mechanisches Versagen und Stenose geplagt.

Gewebezüchtungen trachealen Transplantate (TETGs) können möglicherweise diese Probleme anzugehen, unter Vermeidung der Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression. In den letzten zehn Jahren wurden TETGs im Tiermodell getestet und klinisch eingesetzt, in seltenen Fällen von compassionate-Use^1,2,3. In sowohl großen als auch klinische Untersuchungen an Tieren, postoperative Erholung von Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz benötigt zahlreiche Interventionen zur Bekämpfung Stenose (definiert als > 50 % luminalen Verengung) und Durchgängigkeit der Atemwege zu erhalten. Zusätzliche TETG Arbeit hat versucht, diese Stenose durch Bewertung der Rolle der Zelle Aussaat Wahl, Vaskularisierung und Gerüst Design zu reduzieren. Zelle seeding Entscheidungen und Gerüst Design zur Wiederherstellung der native Luftröhre Struktur/Funktion haben sich vor allem auf respiratorische Epithelzellen und Chondrozyten auf verschiedenen decellularized, resorbierbaren und nicht resorbierbaren Gerüsten ausgesät konzentriert. Wie Vaskularisierung wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Stenose spielt, haben andere Gruppen fokussiert auf die Optimierung in Vitro oder heterotopisch Modelle Revaskularisation oder Neoangiogenese⁴zu beschleunigen. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, erfolgreiche Vaskularisierung und gleichzeitig mechanisch kompetent und funktionelle TETG zu erreichen. Trotz der jüngsten Fortschritte bleibt die Minimierung der Stenose eine kritische Hindernis für klinische Übersetzung.

Um diese histopathologische Reaktion auf TETG Implantation in Vivozu untersuchen, haben wir eine Schafe Gewebezüchtungen trachealen Ersatz-Modell entwickelt. Das Transplantat bestand aus einer gemischten Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU)-Electrospun-Gerüst mit dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen (BM-MNU) ausgesät. In dieser kleinen Kohorte haben wir bewiesen, dass gesetzte autologe BM-MNCs Re Epithelisierung beschleunigt und Stenose^{5 verzögert}. Aussaat mit autologen BM-MNCs verbessert überleben, bleibt unklar jedoch der zelluläre Mechanismus durch den BM-MNCs die Bildung von funktionalen Neotissue modulieren.

Untersuchung auf der zellulären Ebene erforderlichen Entwicklung ein Mausmodell des Gewebes entwickelt trachealen Ersatz. Ähnlich wie bei den Schafen Studie, wir nutzten ein PET:PU Electrospun Gerüst ausgesät mit BM-MNCs. in Übereinstimmung mit den Schafen Modell TETG Stenose entwickelt im Laufe der ersten zwei Wochen nach Implantation^{1,2,3 ,5}. Dies suggeriert, dass das Mausmodell die Pathologie zuvor beobachtet es uns ermöglicht, weiter die zellulären Mechanismen, die Atemwege Stenose Verhören zusammengefaßt.

In diesem Bericht beschreiben wir unser Protokoll für Tissue Engineering trachealen Ersatz im Mausmodell einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation (Abbildung 1, Abbildung 2).

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am bundesweiten Kinderkrankenhaus genehmigt.

(1) Gerüst Herstellung

1. Vorbereiten eine Polymerlösung Nanofaser Vorläufer von: (1) Auflösung 8 Gew.-% PET in 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol und Heizlösung auf 60 ° C und durch 2) auflösen 3 Gew.-% PU in 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol bei Raumtemperatur.
2. Sobald Sie abgekühlt, kombinieren Sie die Lösungen um eine endgültige Polymer-Mischung aus PET und PU (20: 80) zu erstellen.
3. Electrospin die PET+ PU-Lösung auf einem Stab aus rostfreiem Stahl (Durchmesser 1 mm) unter Verwendung einer 20 G stumpfe Spitze Nadel auf eine 60 mL-Spritze gefüllt mit der PET:PU-Lösung mit einem Hochspannungs-DC Power Supply Satz bis + 14 kV auf der Nadel, ein weiterer Hochspannungs-Gleichstrom liefern auf-3 kV , eine 5 mL/h Durchflussmenge und Tipp-Substrat 20 cm Abstand. Drehen Sie die Rute bei 350 u/min während der Abscheidung der Faser.
4. Elektrospinnen weiter, bis die gewünschte Gerüst Wandstärke von 300 µm erreicht ist. Schieben Sie das Gerüst aus der Rute, dann halten sie unter Vakuum über Nacht, restliche Lösungsmittel zu entfernen.
5. Das Gerüst mit einer ultravioletten Licht Dosierung von 350 mJ/cm² vor der Implantation zu sterilisieren.

(2) dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen (BM-MNC) Ernte

1. Einschläfern ein 6-8 Wochen alt, Weiblich, C57BL/6 Maus mit einem Cocktail von Ketoprofen (10 mg/kg), Ketamin (200 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg). Suchen Sie komplette Euthanasie von Heck-Pinch-Methode. Achten Sie darauf, lokale Richtlinien für die Sterbehilfe.
2. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Haut über den Oberschenkelknochen und Schienbeine, Knochen mit feinen Schere und Micro-Adson Pinzette verfügbar zu machen. Verwenden Sie Dumont Nr. 5 Zangen und Pinzetten Dumont Nr. 5/45, die Faszie und die Sehnen entfernen. Trennen Sie die Knochen zu und schneiden Sie jeder von ihnen an den beiden Enden. Mit einer 5 mL Spritze und Nadel 25G, spülen Sie das Knochenmark in einer Petrischale mit 30 mL eine Park Memorial Institute (RPMI) Medien. Filtern Sie diese RPMI mit Knochenmark durch eine 70 µm Nylon Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube.
3. Legen Sie in einem Schrank Biosafety 5 mL Polysurcrose und Natrium-Diatrizoate in der 15 mL Tube. Fügen Sie sanft die RPMI Knochenmark mononukleären Zellen auf der Seite des Rohres, um zu vermeiden, Mischen der beiden Schichten. Zentrifuge bei 461 X g für 30 min mit "Bremse 1" bei 24 ° C.
   Hinweis: Auf unserer Zentrifuge laufen Bremse 1 steht für die längste Zeit während der Verzögerung.
4. Verwerfen Sie aus den drei Schichten gebildet die oberste (rosa) Schicht des Plasmas und sammeln Sie die Mittelschicht (klare), bestehend aus dem Knochenmark mononukleären Zellen zu. Entsorgen Sie die Ausfällung von roten Blutkörperchen.
5. Verdünnen Sie die Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem Verhältnis 1:1 und Zentrifuge bei 461 X g für 10 min mit "Bremse 9" bei 24 ° C.
6. Den Überstand zu entfernen und das Pellet mit 5 mL PBS verdünnen. Zentrifuge bei 461 X g für 10 min mit "Bremse 9" bei 24 ° C.
7. Den Überstand zu entfernen und das Pellet mit ~ 10 mL RPMI verdünnen.
8. Verdünnen Sie 10 µL der BM-MNC-Lösung mit einem gleichen Volumen 0,4 % Trypan blau in einer 1-mL-Tube. Platz 10 µL der Lösung in einer Zelle zählen Kammer Folie. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Wiederholen Sie den Schritt und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen.
   Hinweis: Die Verwendung von zwei Spender Mäusen wurde eine durchschnittliche Zellzahl von 1 X 10-⁸ -Zellen entnommen. Dies wäre gleichbedeutend mit zwei Oberschenkelknochen und zwei Schienbeine, die Knochen Knochenmark von isoliert ist.
9. Zentrifugieren Sie die BM-MNC-Lösung bei 461 X g für 10 min. mit "Bremse 9" bei 24 ° C. Den Überstand zu entfernen und die Zellkonzentration, 10⁷ Zellen/Transplantat verdünnen.
   Hinweis: Wir haben Aussaat Effizienz zwischen 1, 10 und 100 Millionen Zellen untersucht und festgestellt, dass 10 Millionen Zellen pro Graft ergibt die höchste Effizienz der Aussaat.

3. Zelle Aussaat auf die Transplantate

1. Messen Sie die Länge der Gerüste und wenn nötig, schneiden Sie sie auf eine Länge von 5 mm.
2. Vornässen Sie das Gerüst mit 5 µL RPMI für 5 min. entfernen die RPMI.
3. Das Lumen des Gerüstes für 10 min 5 µL der BM-MNC-Lösung hinzufügen.
4. Führen Sie eine Nadel 21G durch das Lumen des Transplantats und inkubieren Sie das Transplantat in 1000 µL RPMI über Nacht bei 37 ° C in einem Inkubator.

(4) Graft Implantation

Hinweis: In der Graft-Implantation aseptischen Technik weiterhin sollte darauf geachtet werden.

1. Verwenden Sie 6-8 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen als Empfänger für die Zelltransplantation ausgesät. Enrofloxacin (10mg/kg) subkutan 24 h vor der Operation und unmittelbar vor Schnitt zu injizieren.
2. Wiegen die Maus und Verwalten einer 0,1 mL/10 g-Dosis von der Narkose Cocktail Ketoprofen (5 mg/kg), Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) als Analgesie intraperitoneal.
3. Überprüfen Sie, ob das Flugzeug der Anästhesie von Heck-Pinch-Methode erreicht worden ist. Bestätigung der Höhe der Sedierung, gelten eine sterile ophthalmologische Salbe für die Augen und die Haare an der Operationsstelle vom Kinn, Schlüsselbeine clip. Legen Sie das Tier auf ein Pad in einem Liegerad Rückenlage. Desinfizieren der Operationsstelle zunächst mit einer Povidon-Jod Prep Pad, gefolgt von einer Prep Alkoholtupfer (70 % Alkohol), und einmal mehr eine Povidon-Jod Prep Pad.
4. Legen Sie das Tier unter dem sezierenden Mikroskop mit seinem Kopf entfernt der Chirurg. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt von den Schlüsselbeinen bis hin zu Zungenbeins mit Hilfe von feinen Schere und Micro-Adson Pinzette. Reinigen Sie die Faszie mit Dumont Nr. 5 und Dumont #7 feine Pinzette, zusammen mit einem sterilen Wattetupfer, wenn nötig, und fügen Sie einen selbsthaltenden Colibri-Retraktor.
5. Öffnen Sie die Gurt Muskeln(Abbildung 3)mit Dumont #5 und #7 Dumont feine Pinzette, setzen die Schilddrüse Knorpel, Ringknorpel Knorpel und der Luftröhre. Unverblümt trennen Sie die Luftröhre von der wiederkehrenden Kehlkopfnerven laufen parallel auf beiden Seiten, gefolgt von umlaufenden Trennung der Luftröhre vom Ösophagus (Abb. 3B).
6. Mit einem 20G Nadel und chirurgische Marker, Flecken Sie auf den vorderen Teil der Luftröhre.
7. Die Luftröhre zu identifizieren und einen Einschnitt unter dem dritten trachealen Knorpel-Ring und Transekt der Luftröhre mit Vannas-Tübingen Frühjahr Schere und ein paar feine Pinzette Dumont Nr. 7. Halten es mit der feinen gebogenen Pinzette, sichern der distalen Luftröhre, das Brustbein mit sterilen 9-0-Nylon-Naht erstellen Sie eine temporäre Tracheostomie (Abb. 3C). Hinweis: Eine alternative Nahtmaterial, das verwendet werden kann ist der 9-0 PDS für trachealen Implantation und Muskel Wiederannäherung.
8. Färben Sie mit einer 20G-Nadel und eine chirurgische Marker das Transplantat um den vorderen Teil darzustellen.
9. Implantation der Prothese einsetzen der proximalen-Posterior, proximal Lateral und proximalen vorderen Nähte, in dieser Reihenfolge mit 9-0 sterile Nylon Naht (Abbildung 3D), Dumont #7 feinen Pinzette und einem Nadelhalter.
10. Drehen Sie die tierischen 180° um seine Rute entfernt der Chirurg zu platzieren. Lassen Sie die temporäre Tracheostomie. Die distale Luftröhre ist unvollständig durchtrennten um die Verwendung des Segments resezierten als einem Baumstumpf auf Widerruf zu ermöglichen. Wenn nicht mehr benötigt, ist das 5 MM Luftröhre Segment vollständig entfernt.
11. Füllen Sie die distale Anastomose, indem man die Fäden in ähnlicher Weise wie die proximale Anastomose.
12. Wieder annähernd die Transplantat-Position und das Gurtband Muskeln. Schließen Sie den Schnitt mit 9-0 sterile Nylon Fäden in einem laufenden Muster.
13. Injizieren Sie 0,1 mL von Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zu und legen Sie das Tier in einem Recovery-Käfig auf ein Heizkissen ohne andere Tiere in den Käfig gesetzt.
14. Beobachten Sie die Maus, bis es ist bewusst und in der Lage, ambulate, dann übertragen Sie die Maus zu einem neuen Käfig mit weichen Betten, feucht Chow und heilkräftige Wasser (Ibuprofen, 30 mg/kg) für 48 h. Nach dieser Zeit die Maus zurück zu einem normalen Käfig mit anderen Mäusen.
    Hinweis: Die Mäuse, die Atemnot zu erhalten oder verringerte Aktivität nach der Implantation werden von Laborstudien und/oder Tier Personal in einem Inkubator 32 ° C beobachtet. Wenn dies für mehr als 48 Stunden anhält, sollte die Mäuse eingeschläfert werden.

5. Histologie und Immunhistochemie

Hinweis: Hämatoxylin und Eosin Flecken wurden mit Standardtechnik durch bundesweit Kinder Krankenhaus Morphologie Kern durchgeführt. Immunohistochemistry erfolgte entsprechend der unten aufgeführten Schritte.

1. Die Folien deparaffinize H₂O (dH₂O) für 5 min mit Xylol (1) für 5 min, 2) Xylol für 5 min, 3) 100 % Ethanol für 5 min, 4) 90 % Ethanol für 5 min, 5) 70 % Ethanol für 5 min, 6) destilliert.
2. Tauchen Sie die Folien in Citrat-Puffer und in Wasser gefüllten Topf legen. Hitze für 10 Minuten dann auf Zimmertemperatur abkühlen lassen. Waschen Sie mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA-PBS) PBS für 5 min. Spülen mit dH₂O.
   Hinweis: Heizung kann auch mit einem heißen Wasserbad oder Mikrowelle für 15 min erfolgen.
3. Inkubieren Sie die Folien mit 3 % normalem Ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen mit 0,1 % BSA-PBS für 5 min. inkubieren im primären Antikörper mit Konzentrationen für Keratin 5 (1: 1000)⁶, Keratin 14 (1: 250)⁶ und F4/80 (1: 100)⁷ 18 h über Nacht bei 4 ° C.
4. Mit 0,1 % BSA-PBS zweimal für 10 min jeweils waschen waschen. Mit entsprechenden Sekundärantikörper in Konzentration von 1: 500 für K5/K14 und 1: 300 F4/80 für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit 0,1 % BSA-PBS zweimal für 10 min jeweils waschen waschen.
5. Halterung mit 4', 6-Diamidino-2-Phenolindole (DAPI) mit Montage Medien und Glas Deckel rutscht. Für 30 min vor Bildgebung sitzen lassen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des TETG Aussaat und Implantation. Knochenmark von Mäusen C57BL/6 geerntet wurde und in Vitrokultiviert. BM-MNCs wurden durch Dichte Zentrifugierung isoliert und auf den TETG ausgesät. Kernigen TETGs wurden in einem Phänomen C57BL/6 Empfänger Maus implantiert.

Abbildung 2 zeigt eine Übersicht über die PET:PU...

Diskussion

Entwicklung von einem Maus-Modell für Gewebezüchtungen Tracheas ist wesentlich für das Verständnis der Faktoren, die klinische Übersetzung von der TETGs begrenzt haben; nämlich Transplantat Zusammenbruch, Stenose und verzögerte Epithelisierung⁴. Ein paar Faktoren, die zu diesen Einschränkungen zählen Transplantat Materialauswahl, den Herstellungsprozess, Gerüst Design und Zelle Aussaat Protokolle. Dieses Modell ermöglicht eine schnellere Auswertung dieser Faktoren Verständnis der zellu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20