Tohum ve bir biyosentetik doku Mühendisliği trakeal greft bir fare modeli implantasyonu

Özet

Greft stenoz mühendislik doku hava yolu değiştirme kritik bir engel teşkil etmektedir. Stenoz temel hücresel mekanizmaları araştırmak için bir fare modeli doku Mühendisliği trakeal değiştirme numaralı seribaşı kemik iliği mononükleer hücreler (BM-MNC) kullanmaktadır. Burada, iskele imalatı, BM-MNC yalıtım, greft tohum ve implantasyon dahil olmak üzere bizim Protokolü ayrıntılı.

Özet

Konjenital veya ikincil uzun segment trakeal kusurları için tedavi seçenekleri tarihsel olarak fonksiyonel doku yerine bir yetersizlik nedeniyle sınırlı olmuştur. Doku Mühendisliği hücreleri ve sinyal molekülleri 3 boyutlu bir iskele entegre gerçekleştirememesine neden olan olası bir çözüm olarak büyük söz sahibidir. Son iş mühendislik doku trakeal Greftler (TETGs) ile bazı başarı gördü ama onların çeviri greft stent tarafından sınırlı, Daralt grefti ve epithelialization gecikmiş. Bu sorunlar sürüş mekanizmaları araştırmak için doku Mühendisliği trakeal greft implantasyonu için bir fare modeli geliştirdik. TETGs electrospun polimerler polietilen tereftalat (PET) ve poliüretan evde beslenen hayvan ve PU (20:80 yüzde ağırlığı) karışımı kullanılarak inşa. İskele sonra seribaşı 6-8 haftadan izole kemik iliği mononükleer hücreler kullanma-eski C57BL/6 fareler degrade Santrifüjü tarafından. Greft başına on milyon hücre iskele Lümen tohumlari ve implantasyon üçüncü ve yedinci trakeal halkalar arasında önce gecede kuluçkaya için izin. Bu greft stenoz bulguları özetlemek başardık ve histolojik analizi ve Keratin 5 ve Keratin 14 Bazal epitelyal hücreler üzerinde ayirt eksikliği tarafından gösterildiği gibi epithelialization gecikmiş. Bu model hücresel ve moleküler mekanizmaları remodeling konukçuda ilgili soruşturma için bir araç olarak hizmet verecek.

Giriş

Uzun segment trakeal kusurları tam trakeal halkalar ve trakeal agenezi, hem de travma, malignite ve enfeksiyon gibi nadir konjenital koşullar olarak sunabilirsiniz. Yetişkin ve çocuklarda trakeal uzunluğu % 30'u 6 cm aşıldığında, bu kusurları cerrahi rekonstrüksiyon tarafından tedavi edilemez. Otolog doku, kadavra nakli ve yapay yapıları ile hava yolu yerine girişimleri, kronik enfeksiyon, granülasyon, mekanik arıza ve stenoz tarafından rahatsız olması.

Mühendislik doku trakeal Greftler (TETGs) büyük olasılıkla ömür boyu immünosupresyon ihtiyacını kaçınırken bu sorunları ele alabilir. Son on yılda TETGs hayvan modellerinde test edilmiş ve klinik olarak şefkatli kullanım^1,2,3nadir durumlarda kullanılmaktadır. Hem klinik hem de büyük hayvan çalışmalarında mühendislik doku hava yolu yerine ameliyat sonrası kurtarma çok sayıda müdahaleler savaş stenoz için gerekli (olarak tanımlanan > % 50 luminal daralma) ve hava yolu a_ılabilinirse korumak. Ek TETG çalışma seçim, vaskülarizasyon ve İskele tasarımı tohum hücrenin rolünün değerlendirilmesi yoluyla bu stenoz azaltmak yollarını araştırmıştır. Hücre tohumlama seçimler ve yerel Trakea yapısı/işlevi geri yükleme adlı amaçlı iskele tasarımı esas olarak solunum epitel hücreleri ve çeşitli tekrar Emilebilen, tekrar Emilebilen sigara ve decellularized iskele üzerinde seribaşı kondrosit odaklı olması. Vaskülarizasyon büyük olasılıkla stenoz gelişiminde önemli bir rol oynarken, diğer gruplar vitro veya heterotopik modelleri revaskülarizasyon veya neoangiogenesis⁴hızlandırmak için optimize üzerinde odaklanmıştır. Bununla birlikte, aynı zamanda mekanik olarak yetkili ve fonksiyonel TETG koruyarak başarılı vaskülarizasyon elde bir meydan kalır. Son gelişmeler rağmen stenoz minimize klinik çeviri için kritik bir engel kalmıştı.

Bu histopatolojik yanıt-e doğru TETG implantasyon vivo içindearaştırmak için doku Mühendisliği trakeal yerine ovine bir model geliştirdi. Greft karışık polietilen tereftalat (PET) ve kemik iliği türevi mononükleer hücreler ile (BM-çok uluslu şirketler) numaralı seribaşı poliüretan (PU) electrospun iskele oluşmaktadır. Bu küçük kohort, numaralı seribaşı Otolog BM-çok uluslu şirketler yeniden epithelialization hızlandırılmış ve stenoz⁵gecikmeli gösterdi. Otolog geliştirilmiş BM-çok uluslu şirketler hayatta kalma ile tohum rağmen hangi işlevsel neotissue oluşumu BM-çok uluslu şirketler modüle hücresel mekanizma belirsizdir.

Bir fare modeli doku hücresel düzeyde gerekli gelişimi üzerinde soruşturma trakeal değiştirme mühendislik. Benzer şekilde ovine çalışma, biz bir PET:PU electrospun iskele BM ile seribaşı kullanılan-ovine modeli, implantasyon^{1,2,3 aşağıdaki ilk iki hafta boyunca geliştirilen TETG stenoz ile tutarlı çok uluslu şirketler. ,5}. Bu fare modeli daha fazla hava yolu darlığı temel hücresel mekanizmaları sorguya çekmek olanaklı kılar daha önce gözlenen patoloji recapitulated ileri sürdü.

İskele imalatı, BM-MNC yalıtım, tohum greft ve implantasyon (Resim 1, Resim 2) de dahil olmak üzere fare modeli trakeal yedek doku mühendisliği için bu raporda, biz bizim protokol ayrıntı.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Nationwide Çocuk Hastanesi tarafından onaylanmıştır.

1. İskele imalatı

1. Bir polimer nanofiber öncü çözüm tarafından hazırlamak: 1) eriterek 8 wt evde beslenen hayvan 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol ve 60 ° c ve çözüm Isıtma 2) 3 wt % PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol oda sıcaklığında içinde eriterek tarafından %.
2. Soğutmalı sonra evde beslenen hayvan ve PU (20:80) final polimer karışımı oluşturmak için çözümler birleştirin.
3. PET:PU çözüm ile dolu bir 60 mL şırınga üzerinde 20 G künt ucu iğne kullanan PET+ PU çözüm bir paslanmaz çelik çomak (1 mm çap) üzerine yüksek voltajlı DC güç kaynağı seti + 14 için kullanarak kV üzerinde iğne, başka bir yüksek voltajlı DC güç kaynağı -3 kümesine Electrospin kV , bir 5 mL/saat'e kadar debi ve 20 cm ipucu substrat uzaktan. Çubuk 350 devirde fiber ifade sırasında döndürün.
4. İstenen iskele kalınlığı 300 µm elde kadar electrospinning devam edin. İskele çubuk kapalı kaydırın, sonra kalan herhangi bir solvent kaldırmak için vakum altında gecede basılı tutun.
5. 350 mJ/cm² implantasyon öncesinde bir ultraviyole ışık doz kullanarak iskele sterilize.

2. kemik iliği türevi mononükleer hücre (BM-MNC) hasat

1. 6-8 hafta ötenazi yaşlı, kadın, C57BL/6 fare ile bir kokteyl ketamin (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg) ve ketoprofen (10 mg/kg). Tam ötenazi için kuyruk tutam yöntemi ile kontrol edin. Ötenazi için yerel yönergeleri izleyin emin olun.
2. Steril koşullarda, uyluk ve kemik iyi makas ve mikro-Adson forseps kullanarak ortaya çıkarmak için yırtılmalarıteşhis üzerinde cilt kaldırın. Dumont #5 forseps ve Dumont #5/45 forseps fasya ve tendonlar kaldırmak için kullanın. Kemikleri ayırmak ve her biri iki ucunda kesti. 5 mL şırınga ve bir 25 G iğne kullanarak, bir petri Rosewell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) medya 30 mL içeren kemik iliğinde sifonu çek. Bu RPMI kemik iliği ile 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL tüp içine filtre.
3. Bir biyogüvenlik dolapta 5 mL polysurcrose ve sodyum diatrizoate 15 mL tüp içinde de yerleştirin. Yavaşça iki katmanları karıştırma önlemek için kemik iliği mononükleer hücre tüp tarafı aşağı içeren RPMI ekleyin. 461 x g ile 30 dk için de "1 24 ° C'de fren" santrifüj
   Not: bizim santrifüj fren 1 standları için en uzun zaman yavaşlama sırasında çalıştırın.
4. Üç katmandan oluşan, plazma (pembe) üst tabakası atmak ve kemik iliği mononükleer hücrelerin oluşan orta (net) tabaka toplamak. Kırmızı kan hücrelerinin çökelti atmak.
5. Kemik iliği mononükleer hücrelerde (BM-MNC) fosfat tamponlu tuz (1:1 oran ve 461 x g , santrifüj ile 10 dakika içinde "fren 9" PBS) 24 ° C'de sulandırmak
6. Süpernatant kaldırmak ve 5 mL de PBS ile Pelet oranında seyreltin. 461 x g ile 10 min için de "9 24 ° C'de fren" santrifüj
7. RPMI ~ 10 mL ile Pelet sulandırmak ve süpernatant çıkarın.
8. BM-MNC çözüm 10 µL % 0,4 trypan 1 mL tüpte mavi eşit bir birimdeki sulandırmak. Hücrede odası slayt sayımı çözümünün yer 10 µL. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Adımı tekrarlayın ve hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın.
   Not: Bir ortalama hücre sayısı 1 X 10⁸ hücre iki donör fare kullanımından elde edildi. Bu iki uyluk için eşdeğer olacaktır ve kemik iliği iki yırtılmalarıteşhis yalıtılmış.
9. BM-MNC çözüm 461 x g 10 min için de "Fren ile 9" 24 ° C'de santrifüj kapasitesi Süpernatant kaldırmak ve hücre konsantrasyonu 10⁷ hücreler/greft için sulandırmak.
   Not: Biz verimliliği 1, 10 ve 100 milyon hücre arasında tohum okudu ve greft başına 10 milyon hücre en yüksek tohum verimi verir bulundu.

3. hücre üzerinde Greftler tohumlama

1. İskele uzunlukları ölçmek ve gerekirse, 5 mm uzunluğa kesin.
2. İskele RPMI 5 µL 5 dk. Kaldır RPMI ile önceden ıslak.
3. BM-MNC çözüm 5 µL 10 min için iskele Lümen ekleyin.
4. 21 G iğne greft Lümen üzerinden geçmek ve RPMI 1000 µL gecede 37 ° C'de bir kuluçka greft kuluçkaya.

4. greft implantasyonu

Not: Greft implantasyonu işlem sırasında aseptik teknik korumak için özen gösterilmelidir.

1. 6-8-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 fareler numaralı seribaşı hücre nakli için alıcı kullanın. Enrofloksasin (10 mg/kg) subkutan 24 h ameliyattan önce ve hemen önce kesi enjekte et.
2. Fare tartmak ve anestezik kokteyl ketamin (100 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) ve ketoprofen (5 mg/kg) 0.1 mL/10 g doz analjezi intraperitoneally yönetmek.
3. Anestezi uçağın kuyruk tutam yöntemiyle elde Eğer kontrol edin. Sedasyon düzeyi teyit, gözleri bir steril oftalmik merhem uygulamak ve çene cerrahi sitesinden kalçakemiği için saç küçük. Hayvan dorsal yaslanmış pozisyon bir yastık üzerinde bir yer. Önce bir alkol hazırlık pad (% 70 alkol), ardından bir povidone-iyot hazırlık defteri ve bir kez daha povidone-iyot hazırlık paneli kullanarak cerrahi sitesi dezenfekte.
4. Hayvan ile onun baş cerrah uzak diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Kalçakemiği iyi makas ve mikro-Adson forseps yardımıyla kemiği arasında değişen bir ensizyon olun. Şerit Dumont #5 ve bir steril pamuklu çubukla seçin ve kendi kendine istinat Colibri Retraktörü ekle birlikte Dumont #7 iyi Forseps ile temizleyin.
5. Kayış kasları (şekil 3A) tiroid kıkırdak, krikoid kıkırdak ve trakea duyurmak Dumont #5 ve Dumont #7 iyi Forseps ile açın. Açık açık Trakea Trakea sirkumferansiyel ayrılması tarafından yemek borusu (şekil 3B) ardından iki tarafında paralel çalışan tekrarlayan gırtlak sinirler ayırmak.
6. 20 G iğne ve cerrahi işaretleyici kullanarak, nefes borusu ön kısmını leke.
7. Trakea tanımlamak ve üçüncü trakeal kıkırdak halka aşağıda bir kesi yapıp kenasen-Tübingen bahar makas ve bir çift Dumont #7 iyi forseps kullanarak Trakea transect. İnce kavisli Forseps ile tutarak, distal Trakea steril kullanarak göğüs kemiği için 9-0 naylon dikiş geçici trakeostomi (şekil 3C) oluşturmak için güvenli. Not: 9-0 PDS trakeal implantasyon ve kas reapproximation için kullanılabilir bir alternatif suture maddi var.
8. 20 G iğne ve cerrahi bir marker ile ön bölümü temsil etmek için greft leke.
9. Proksimal-arka, lateral proksimal ekleme greft implant ve 9-0 steril naylon dikiş (şekil 3D), Dumont #7 kullanarak bu sırayla proksimal ön dikiş forseps ve bir iğne bağı gayet iyi.
10. Kuyruğunu cerrah uzak yerleştirmek için hayvan 180 ° dönüş. Geçici trakeostomi serbest bırakın. Distal Trakea eksik olarak geri çekilmesi bir güdük olarak rezeke segment kullanımına izin vermek için kesmiş. Artık gerekmediğinde, 5 MM Trakea segmenti tümüyle kaldırılır.
11. Distal anastomoz yapmama yanında duvar ilanı dikiş Proksimal Anastomoz benzer biçimde tamamlayın.
12. Greft konumu ve kayış kasları yeniden yaklaşık. 9-0 steril naylon dikiş kullanarak çalışan bir düzen içinde belgili tanımlık kesme kapatın.
13. Subkutan buprenorfin (0.1 mg/kg) 0.1 mL enjekte ve diğer hayvanlar içinde belgili tanımlık kafes olmadan bir Isıtma yastığı yerleştirilen bir kurtarma kafes hayvan yer.
14. Bilinçli ve güçlü-e doğru ambulate, daha sonra fareyi yumuşak yataklar, nemli chow ve 48 h için tıbbi su (ibuprofen, 30 mg/kg) ile yeni bir kafes transfer kadar fareyi gözlemlemek. Bu süre sonunda, normal bir kafes ile diğer fareler fare dönün.
    Not: solunum korumak veya etkinlik implantasyon sonra azalmıştır fareler 32 ° C kuluçka laboratuvar ve/veya hayvan personel tarafından gözlenir. O zaman bu daha 48 h devam ederse, fareler euthanized.

5. Histoloji ve immünhistokimya

Not: Hematoksilen ve Eozin lekeleri standart tekniği kullanarak Nationwide Çocuk Hastanesi Morfoloji çekirdek tarafından yapıldı. İmmünhistokimya gerçekleştirilen göre aşağıdaki adımları.

1. Slaytlar deparaffinize 1) Ksilen kullanarak 5 dk, Ksilen 2) 5 dk, 5 dk, 5 dk için % 4) 90 etanol, 5 min için % 5) 70 etanol etanol 3) %100 6) distile H₂O (dH₂O) 5 min için.
2. Sitrat arabellek slaytları daldırın ve su dolu düdüklü tencere içinde yer. 10 dakikadır ısı sonra oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. DH₂O. ile 5 dk. durulama için %0,1 sığır serum albümin PBS (BSA-PBS) içinde yıkayın
   Not: Isıtma da sıcak su banyosu veya 15dk için mikrodalga ile yapılabilir.
3. Oda sıcaklığında 1 h için PBS içinde % 3 normal keçi serum slaytlarla kuluçkaya. % 0.1 ile yıkama BSA-PBS 5 dakika süreyle kuluçkaya keratin için konsantrasyonları ile birincil antikor içinde 5 (1: 1000)⁶, keratin 14 (1:250)⁶ ve 4 ° C'de gecede 18 h için F4/80 (1: 100)⁷
4. % 0.1 BSA-PBS iki kez her 10 dakikadır yıka yıka. 1:500 konsantrasyonu K5/K14 ve 1:300 F4/80 oda sıcaklığında 1 h için uygun ikincil antikor ile kuluçkaya. % 0.1 BSA-PBS iki kez her 10 dakikadır yıka yıka.
5. Montaj medya ve cam kapak makbuzları içeren 4', 6-diamidino-2-phenolindole kullanarak takma (DAPI). 30 dk önce görüntüleme için oturmak için izin verir.

Sonuçlar

Şekil 1 bir şematik TETG tohum ve implantasyon göstermektedir. Kemik iliği C57BL/6 fare--dan hasat ve vitrokültürlü. BM-çok uluslu şirketler tarafından yoğunluk Santrifüjü izole ve TETG numaralı seribaşı. Numaralı seribaşı TETGs syngeneic C57BL/6 alıcı fareye implante edildi.

Şekil 2 üretim süreci PET:PU TETG iskele bir bakış niteliği...

Tartışmalar

Bir fare modeli için tasarlanmış doku tracheas TETGs klinik çeviri sınırlı faktörleri anlamak gerekli bir gelişmedir; Yani greft Daralt, stenoz ve gecikmiş epithelialization⁴. Bu sınırlamalar için katkıda birkaç faktör greft malzeme, üretim süreci, iskele tasarımı ve protokolleri tohum hücre içerir. Bu modeli bu faktörlerin daha hızlı değerlendirme için onları etkileyen hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için izin verir.

Biz bura...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20