Заполнение и имплантации биосинтетических ткани инженерии трахеи трансплантата в мышиной модели

Резюме

Трансплантат стенозом критических препятствием в инженерии ткани дыхательных путей замены. Расследовать клеточных механизмов лежащие в основе стенозом, мы используем модель мышиных трахеи замена ткани инженерии с семенами костного мононуклеарных клеток (БМ-MNC). Здесь мы подробно нашего протокола, включая эшафот производство, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации.

Аннотация

Варианты лечения врожденных или вторичные длинные сегмент трахеи дефектов исторически были ограничены из-за неспособности заменить функциональные ткани. Тканевая инженерия открывает большие перспективы как потенциальное решение с его способностью интегрировать клетки и сигнальных молекул в 3-мерной леску. Последние работы с трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) наблюдается некоторый успех, но их перевод было ограничено трансплантата стенозом, прививка крах и задержки эпителизации. С целью изучения механизмов, вождение эти вопросы, мы разработали модель мыши для имплантации трахеи лоскута ткани инженерии. TETGs были построены с использованием electrospun полимеров полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) в смеси ПЭТ и ПУ (вдохновившей % веса). Подмости затем были посеяны, используя мононуклеарных клеток костного мозга, изолированных от 6-8 недели-старых мышей C57BL/6, градиентного центрифугирования. Десять миллионов клеток за графт были посеяны на просвет эшафот и разрешено инкубировать на ночь перед имплантацией между третьей и седьмой трахеи кольца. Эти смогли резюмировать выводы стеноза и задержки эпителизации, как свидетельствует гистологический анализ и отсутствием кератин 5 и 14 кератин базальных клеток эпителия на иммунофлюоресценции. Эта модель будет служить инструментом для исследования клеточном и молекулярном механизмами, задействованными в принимающей ремоделирования.

Введение

Лонг сегмент трахеи дефекты можно представить как редких врожденных заболеваний как полный трахеи кольца трахеи агенезия, а также травмы, злокачественности и инфекции. Когда более 6 см в 30% от длины трахеи у детей или взрослых, эти дефекты не могут рассматриваться по хирургической реконструкции. Попытки заменить дыхательных путей с аутологичной ткани, трансплантации трупной и искусственные конструкции были страдает от хронической инфекции, грануляции, механических повреждений и стенозом.

Трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) потенциально может решить эти проблемы избегая необходимость непрерывного иммунодепрессией. В течение последнего десятилетия были протестированы на животных моделях и клинически используется в редких случаях сострадательного использование^1,2,3TETGs. В как в клинических, так и в крупных исследованиях на животных, послеоперационное восстановление из ткани инженерии сократимость замены требуются многочисленные мероприятия по борьбе с стеноза (определяется как > 50% Люминал сужения) и поддержание проходимости дыхательных путей. Дополнительная работа TETG стремился уменьшить этот стеноз путем оценки роли ячейки посева выбора, васкуляризации и дизайн эшафот. Высева выбор ячейки и дизайн эшафот, направленных на восстановление родной трахеи структуры/функции главным образом уделялось эпителиальных клеток дыхательных путей и хондроцитов посеян на различных рассасывающимся, не рассасывающимся и decellularized леса. Как васкуляризации вероятно играет важную роль в развитии стенозом, другие группы были сосредоточены на оптимизации в пробирке или heterotopic модели для ускорения реваскуляризации или neoangiogenesis⁴. Тем не менее достижение успешных васкуляризации, сохраняя при этом механически компетентным и функциональной TETG остается проблемой. Несмотря на недавние успехи минимизации стенозом остается критическим препятствием для клинических перевод.

Расследовать этот гистопатологические ответ TETG имплантации в естественных условиях, мы разработали баранину модель инженерии ткани трахеи замены. Трансплантат состояла из смешанного полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) electrospun леску семенами с костного мозга-производные мононуклеарных клеток (БМ-МНК). В этой небольшой когорты мы показали, что посеяны аутологичной BM-МНК ускоренного эпителизация и задержки стенозом⁵. Хотя заполнение с аутологичной BM-МНК улучшение выживаемости, сотовой механизм, по которому BM-МНК модулировать формирования функциональных neotissue остается неясным.

Расследование на сотовой уровне требуется развитие мышиных модели ткани инженерии трахеи замены. Подобно к изучению баранину, мы использовали PET:PU electrospun леску семенами с БМ-МНК. в соответствии с моделью баранину, TETG стеноза разработаны в течение первых двух недель после имплантации^{1,2,3 ,5}. Это предполагает, что мышиных модель резюмировалась патологии, отмечалось ранее, позволяя нам далее опросить клеточных механизмов лежащие в основе стеноз дыхательных путей.

В настоящем докладе мы подробно наш протокол для ткани инженерии трахеи замена в модель мыши, включая производство эшафот, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации (рис. 1, рис. 2).

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в стране детской больнице.

1. эшафот производства

1. Приготовляют раствор полимера нановолокно прекурсоров путем: 1) растворения 8 wt % ПЭТ в 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol и Отопление раствора до 60 ° C и 2) растворяют 3 wt % ПУ в 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol при комнатной температуре.
2. После охлаждения, сочетают в себе решения для создания окончательного полимерная смесь ПЭТ и ПУ (вдохновившей).
3. Electrospin пу PET+ раствор на стержень из нержавеющей стали (диаметром 1 мм) используя 20 G тупым кончик иглы на 60 мл шприц, заполненные раствором PET:PU с использованием набора питания питания постоянного тока высокого напряжения до + 14 кв на иглу, другой питания постоянного тока высокого напряжения комплект для поставки -3 кв , 5 мл/ч скорость потока и на расстоянии 20 см наконечник к подложке. Вращаться стержень на 350 об/мин во время волокна осаждения.
4. Продолжайте electrospinning, пока не будет достигнуто желаемого леска толщина стенок 300 мкм. Слайд леску с стержня, а затем провести его под вакуумом на ночь, чтобы удалить любой остаточный растворитель.
5. Стерилизуйте эшафот, с использованием ультрафиолетового света доза 350 МДж/см² до имплантации.

2. костного мозга-производные мононуклеарных клеток (БМ MNC) заготовки

1. Усыпить 6-8 недель старые, женский, C57BL/6 мышь с коктейлем кетамин (200 мг/кг), Ксилазина (20 мг/кг) и кетопрофен (10 мг/кг). Проверьте полный эвтаназии методом хвост пинча. Не забудьте следовать местные руководящие принципы для эвтаназии.
2. В стерильных условиях снять кожу бедра и tibias подвергать кости с помощью тонкой ножницы и микро Adson щипцами. Использование Дюмон #5 щипцы и Дюмон #5/45 щипцы для удаления фасции и сухожилий. Отдельные кости и разрезать каждый из них на обоих концах. С помощью 5 мл шприца и иглы 25G, флеш костного мозга в чашке Петри, содержащих 30 мл Розуэллом парк Мемориальный институт (RPMI) средства массовой информации. Фильтр этот RPMI с костного мозга через стрейнер клеток нейлон 70 мкм в 50 мл трубки.
3. В кабинете биобезопасности место 5 мл polysurcrose и натрия diatrizoate в 15 мл. Аккуратно добавьте RPMI, содержащие мононуклеарных клеток костного вниз стороне трубки, чтобы избежать смешивания двух слоев. Центрифуги, на 461 x g 30 мин с «тормоз 1» на 24 ° C.
   Примечание: На наших центрифуг, стенды тормозные 1 для самой длинной истекло время замедления.
4. Из трех слоев сформирована отказаться от верхнего слоя (розовый) плазмы и собирать среднего (прозрачный) слой, состоящий из мононуклеарных клеток костного мозга. Слейте осадок красных кровяных клеток.
5. Разбавить мононуклеарных клеток костного мозга (БМ-MNC) в-фосфатный буфер (PBS) в соотношении 1:1 и центрифуги на 461 x g 10 мин с «тормоз 9» на 24 ° C.
6. Удалить супернатант и разбавленных лепешка с 5 мл ФСБ. Центрифуги, на 461 x g 10 мин с «тормоз 9» на 24 ° C.
7. Удалить супернатант и разбавленных лепешка с ~ 10 мл RPMI.
8. Развести 10 мкл раствора BM-МНК с равным объемом 0,4% Трипановый синий в 1 мл. Место 10 мкл раствора в ячейке подсчета палата слайд. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток. Повторите шаг и вычислить среднее количество клеток.
   Примечание: Средняя клеток количество клеток 1 X 10-⁸ был получен от использования двух доноров мышей. Это будет эквивалентна двум бедра, и два tibias, которые костного изолирован от.
9. Центрифуга BM-MNC решение на 461 x g 10 мин с «Тормоз 9» на 24 ° C. Удалить супернатант и разбавленных концентрации клеток до 10⁷ клеток/трансплантата.
   Примечание: Мы изучили посева эффективности между 1, 10 и 100 миллионов клеток и обнаружили, что 10 миллионов клеток за графт дает наивысшую эффективность посева.

3. клетки, посев на графтов

1. Мера длины подмостей и в случае необходимости, разрежьте их длиной 5 мм.
2. Предварительно влажные леса с 5 мкл RPMI для 5 минут удалить RPMI.
3. Добавьте 5 мкл раствора BM-MNC в Люмене эшафот за 10 мин.
4. Передайте иглой 21G через просвет трансплантата и инкубировать трансплантата в 1000 мкл RPMI на ночь при 37 ° C в инкубаторе.

4. трансплантата имплантации

Примечание: Следует поддерживать асептической техники во время процедуры имплантации трансплантата.

1. 6-8-недельных самок мышей C57BL/6 можно используйте в качестве получателей для ячейки посеян графтов. Придать Энрофлоксацин (10 мг/кг) подкожно 24 ч до операции и как раз перед разрез.
2. Весят мыши и администрирование доза 0,1 мл/10 g обезболивающий коктейль кетамин (100 мг/кг), Ксилозин (10 мг/кг) и кетопрофен (5 мг/кг) как анальгезии внутрибрюшинно.
3. Проверьте, если был достигнут в плоскости анестезии методом хвост пинча. На подтверждающий уровень седации, применить стерильная глазная мазь для глаз и обрезать волосы на месте операции от подбородка до ключицы. Поместите животное на площадку в спинной лежачем положении. Дезинфекция хирургические сайта, сначала через площадку приготовительный повидон йод, следуют приготовительный площадку алкоголя (70% спирта) и еще раз площадку приготовительный повидон йод.
4. Место животного под микроскопом рассечения с ее головы от хирурга. Сделайте разрез средней линии, от ключицы до подъязычной кости с помощью тонкой ножницы и микро Adson щипцами. Очистите фасции с Дюмон #5 и тонкой щипцы Дюмон #7, наряду с стерильным ватным тампоном если необходимо и вставить Colibri втягивающее устройство самостоятельно сохранить.
5. Откройте ремешок мышцы (рис. 3А) пинцетом Дюмон #5 и #7 Дюмон тонкой подвергать щитовидный хрящ, перстневидного хряща и трахеи. Тупо отделяют трахею от периодических гортани нервы, параллельно по обе стороны, следуют окружные отделения трахеи от пищевода (рис. 3B).
6. С помощью иглы 20G и хирургического маркера, пятно передней части трахеи.
7. Идентифицировать трахеи и надрезают ниже третьего кольца трахеи хряща и разрез трахеи, используя беззаботными Тюбинген весной ножницами и пара Дюмон #7 штрафа щипцами. Держа его с тонкой Изогнутый пинцет, безопасный дистальной части трахеи к грудине, с использованием стерильных шовный материал нейлон 9-0 для создания временной трахеостомические (рис. 3C). Примечание: Альтернативная шовный материал, который может быть использован является 9-0 PDS для трахеи имплантации и мышечную reapproximation.
8. С иглой 20G и хирургического маркера пятно трансплантата для представления в передней части.
9. Имплантат трансплантата, вставки проксимального кзади, проксимальной боковое и проксимальной передней швы, в таком порядке, с использованием 9-0 стерильные нейлон шов (рис. 3D), Дюмон #7 изысканных щипцы и иглодержателя.
10. Поверните животных 180° разместить свой хвост от хирурга. Релиз временные трахеостомические. Дистальная трахеи неполно перерезанных гори разрешить использование резекции сегмента как пень для опровержения. Когда больше не нужен, 5 мм трахеи сегмент удаляется полностью.
11. Выполните дистальной анастомоза, поместив швы в Аналогичным образом как Проксимальная анастомоза.
12. Повторно приблизительный позиции трансплантата и ремешок мышц. Закройте разрез с помощью 9-0 стерильные нейлон швы в шаблон работает.
13. Подкожно вводить 0,1 мл бупренорфин (0,1 мг/кг) и поместите животное в клетке восстановления на грелку без других животных в клетке.
14. Наблюдать за мыши до тех пор, пока это сознательное и способны передвигаться, а затем перенесите мыши в новой клетке с мягкой подстилкой, влажные Чоу и лечебные воды (ибупрофен, 30 мг/кг) в течение 48 часов. После этого периода времени вернуться к нормальной клетке с другими мышами мыши.
    Примечание: Мышей, которые поддерживают респираторного дистресса или снижение активности после имплантации наблюдаются сотрудниками лаборатории и/или животного в инкубаторе 32 ° С. Если это продолжается в течение более чем 48 часов, должен быть euthanized мышей.

5. гистология и иммуногистохимии

Примечание: Гематоксилином и эозином пятна были исполнены с использованием стандартной техники Национальная Детская больница морфология ядро. Иммуногистохимия была выполнена согласно ниже шаги.

1. Deparaffinize слайды с помощью 1) ксилол за 5 мин., 2) ксилол за 5 мин, 3) 100% этанола за 5 мин, 4) 90% этанола за 5 мин, 5) 70% этанола за 5 мин, 6) дистиллированной H₂O (dH₂O) за 5 мин.
2. Опускайте слайды в буфера цитрата и место в заполненные водой скороварки. Тепло в течение 10 мин, затем охладите до комнатной температуры. Вымойте с 0.1% бычьего сывороточного альбумина в PBS (BSA-PBS) для 5 минут промыть с dH₂O.
   Примечание: Отопление также может быть сделано с горячей водой ванну или микроволновую печь на 15 мин.
3. Инкубируйте слайды с 3% нормальной козьего сыворотки в PBS на 1 ч при комнатной температуре. Стирка с 0.1% BSA-PBS на 5 мин инкубировать в основное антитело с концентрации для кератина, 5 (1: 1000)⁶, кератин, 14 (1: 250)⁶ и⁷ F4/80 (1: 100) для 18 h на ночь при 4 ° C.
4. Вымойте с 0,1% BSA-PBS дважды за 10 мин каждый мыть. Проинкубируйте с соответствующие вторичные антитела в концентрации 1: 500 для К5/K14 и 1: 300 F4/80 за 1 ч при комнатной температуре. Вымойте с 0,1% BSA-PBS дважды за 10 мин каждый мыть.
5. Крепление с помощью 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) содержащий монтажа СМИ и стекла Крышка скользит. Позвольте сидеть за 30 мин до изображений.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует схема TETG посева и имплантации. Костный мозг был собран от мышей C57BL/6 и культивировали в пробирке. BM-МНК были изолированы центрифугированием плотности и посеян на TETG. TETGs в сеяный были имплантированы в получателей мышь сингенн?...

Обсуждение

Разработка модели мыши для инженерии ткани трахеи имеет важное значение в понимании тех факторов, которые имеют ограниченные клинические перевод TETGs; а именно крах трансплантата, стеноз и задержки эпителизации⁴. Несколько факторов, которые способствуют эти ограничения вк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20