Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Summary

היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.

Abstract

אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.

Introduction

פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס"מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.

שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-^1,-^2,-³. במחקרים קליניים והן גדולים בעלי חיים, התאוששות החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה לאחר הניתוח הנדרש התערבויות רבות היצרות לחימה (כהגדרתו > היצרות luminal 50%) ולשמור על דרכי הנשימה patency. עבודה נוספת TETG ביקש להפחית את היצרות דרך להעריך את התפקיד של התא זריעה הבחירה, vascularization ועיצוב לגרדום. בחירות זריעה תא ועיצוב לגרדום שמטרתו קנה הנשימה מקורי מבנה/פונקציה יש בעיקר התמקדה בתאי אפיתל נשימתי, chondrocytes נזרע על פיגומים resorbable, שאינם resorbable, decellularized שונים. כפי vascularization סביר ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של היצרות, קבוצות אחרות התמקדו מיטוב במבחנה או מודלים הטרוטופי כדי לזרז revascularization או neoangiogenesis⁴. למרות זאת, השגת vascularization מוצלח תוך שמירה גם TETG המוסמכים ופונקציונליים מכנית נשאר אתגר. למרות ההתקדמות, מזעור היצרות נותר מכשול קריטי תרגום קליניים.

כדי לבדוק תגובה זו histopathological TETG השרשה ויוו, פיתחנו מודל ovine של החלפת רקמות מהונדסים בקנה הנשימה. השתל היה מורכב של פוליאתילן מעורבת terephthalate (PET) פוליאוריטן לגרדום electrospun (PU) עם תאי תאי מח עצם-derived (מוניטור-MNCs). במדגם קטן זה, הפגנו כי הזריעה עצמיים BM-MNCs מואצת epithelialization מחדש, מתעכבת היצרות⁵. למרות זריעה עם ההישרדות השתפרו BM-MNCs עצמיים, מנגנון הסלולר שבה BM-MNCs לווסת את היווצרות neotissue תפקודית נשאר לא ברור.

חקירה על פיתוח הנדרש ברמה התאית מודל מאתר של רקמות מהונדסים החלפת בקנה הנשימה. בדומה ללימוד ovine, אנחנו מנוצל לפיגום electrospun PET:PU עם מוניטור-MNCs. מסתדר עם המודל ovine, היצרות TETG שפותחה במהלך השבועיים הראשונים שלאחר ההשתלה^{1,2,3 ,5}. זה הציע כי המודל מאתר recapitulated את הפתולוגיה שנצפה קודם לכן, ומאפשרת לנו עוד לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות דרכי הנשימה.

בדו ח זה, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו עבור רקמות מהונדסים החלפת והכו אותי במודל עכבר כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה (איור 1, איור 2).

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים ארצית.

1. לגרדום הייצור

1. להכין פתרון קודמן פולימר nanofiber מאת: 1) המסת 8 wt % מחמד 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, חימום הפתרון עד 60 ° צלזיוס, על ידי 2) המסת 3% wt פו 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol בטמפרטורת החדר.
2. ברגע מקורר, לשלב את הפתרונות כדי ליצור תערובת פולימר הסופי של חיית המחמד, פו (20:80).
3. Electrospin הפתרון PET+ פו על גבי מוט פלדה אל חלד (1 מ"מ קוטר), ניצול מחט קצה קהה 20 גרם על מזרק 60 מ ל מלא הפתרון PET:PU באמצעות ערכה אספקת החשמל של DC מתח גבוה כדי +14 kV המחט, עוד כוח DC מתח גבוה לספק מוגדר כ-3 kV , קצב זרימה מ ל/h, ובמרחק עצה-אל-המצע 20 ס מ. לסובב את המוט ב 350 סל"ד במהלך התצהיר סיבים.
4. המשך electrospinning עד עובי קיר לגרדום הרצוי מיקרומטר 300 מושגת. שקופית לגרדום את המוט, ולאחר מכן להחזיק אותו מתחת ואקום למשך הלילה כדי להסיר כל הממס שיורית.
5. לחטא לגרדום באמצעות של מינון אור אולטרה סגול של mJ/ס מ 350² לפני ההשתלה.

2. מח עצם-Derived תא תאי (מוניטור-MNC) קציר

1. המתת חסד של 6-8 שבועות העכבר הישן, נקבה, C57BL/6 עם קוקטייל של קטאמין (200 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג), ketoprofen (10 מ"ג/ק"ג). בדוק המתת חסד מוחלט בשיטה הזנב-קורט. הקפד לעקוב אחר הנחיות מקומיות המתת חסד.
2. תחת תנאים סטריליים, מסירים את העור של עצמות הירך ושל tibias לחשוף את העצם באמצעות מספריים בסדר ומלקחיים מיקרו-לאדאמסון. השתמש דומונט #5 מלקחיים מלקחיים דומונט #5/45 כדי להסיר את הגידים fascia. להפריד בין העצמות וחותכים כל אחד מהם על שני הקצוות. באמצעות מזרק 5 מ ל ו מחט 25 גרם, לרוקן את מח העצם בצלוחית המכילה 30 מ של מדיה המכון ממוריאל פארק Rosewell (RPMI). לסנן את RPMI עם מח עצם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ניילון לתוך צינור 50 מ.
3. במקום ארון אבטחה, 5 מ של diatrizoate polysurcrose ו נתרן בצינור 15 מ"ל. להוסיף בעדינות את RPMI המכיל תאים תאי מח העצם בצד של הצינור כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות. צנטריפוגה ב x 461 g למשך 30 דקות עם "בלם 1" ב- 24 מעלות צלזיוס.
   הערה: על שלנו צנטריפוגה, בלם 1 עומד על פרק הזמן הארוך ביותר להפעיל את משך זמן ההאטה.
4. ללא שלושת השכבות נוצרו, למחוק את השכבה העליונה (ורוד) של פלסמה ולאסוף את השכבה האמצעית (ברור) המורכב של תאי תאי מח העצם. למחוק את התמיסה של כדוריות דם אדומות.
5. לדלל התאים תאי מח העצם (מוניטור-MNC) בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) יחס 1:1, צנטריפוגה ב 461 x g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס.
6. הסר את תגובת שיקוע, לדלל את גלולה עם 5 מ של PBS. צנטריפוגה ב x 461 g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס.
7. הסר את תגובת שיקוע, לדלל את גלולה עם ~ 10 מ"ל של RPMI.
8. לדלל 10 µL של הפתרון BM-MNC עם אמצעי אחסון שווה של 0.4% trypan blue צינור 1 מ"ל. מקום 10 µL של הפתרון בתא ספירה קאמרית שקופית. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית. חזור על השלב ולחשב את המספר הממוצע של תאים.
   הערה: ספירת התאים הממוצע של עונה 1 פרק 10⁸ תאים הושג משימוש של שני עכברים התורם. . זה יהיה שווה ערך ל שתי עצמות הירך, שני tibias אשר עצם מח מנותקת.
9. Centrifuge הפתרון BM-MNC ב x 461 g 10 דקות עם "בלם 9"-24 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, לדלל את ריכוז תא 10⁷ תאים/שתל.
   הערה: יש למד זריעה יעילות בין 1, 10, 100 מיליון תאים ואנו נמצאו 10 מיליון תאים לכל שתל התשואות זריעה היעילות הגבוהה ביותר.

3. תא זריעה על השתלים

1. למדוד את האורך של פיגומים, במידת הצורך, לחתוך אותם לאורך של 5 מ מ.
2. טרום רטוב לגרדום עם 5 µL של RPMI עבור 5 דק. להסיר RPMI.
3. להוסיף 5 µL של הפתרון BM-MNC לומן של לגרדום במשך 10 דקות.
4. לעבור מחט 21G דרך לומן של השתל, דגירה השתל ב 1000 µL של RPMI בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.

4. להשתיל השרשה

הערה: להקפיד לשמור על הטכניקה aseptic במהלך ההליך השרשה שתל.

1. שימוש עכברים C57BL/6 נקבות 6-8-בת שבוע הנמענים עבור השתלים תא נזרע. להזריק enrofloxacin (10 מ"ג/ק"ג) subcutaneously 24 שעות לפני הניתוח, קצת לפני החיתוך.
2. שוקל את העכבר ולפקח מנה 0.1 מ"ל/10 גרם של הקוקטייל הרדמה קטמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ketoprofen (5 מ"ג/ק"ג) כמו שיכוך כאבים intraperitoneally.
3. בדוק אם המטוס של הרדמה הושג בזכות שיטת הזנב-קורט. על המאשרת את הרמה של הרגעה, להחיל משחה אופטלמולוגיות סטרילי לעיניים ולגזור את השיער באתר כירורגית של הסנטר הכסל. במקום החיה על כרית במצב שכיבה הגבי. לחטא באתר כירורגית באמצעות קודם פנקס ההכנה povidone יוד, ואחריו כרית ההכנה אלכוהול (70% אלכוהול), ולא פעם נוספת משטח ההכנה povidone יוד.
4. מקם את החיה תחת המיקרוסקופ ויבתר עם הראש שלה מן המנתח. עושים חתך קו האמצע החל את עצם הבריח עצם הלשון בעזרת מספריים בסדר ומלקחיים מיקרו-לאדאמסון. נקה fascia דומונט #5, מלקחיים בסדר דומונט #7, יחד עם ספוגית כותנה סטרילי אם צריך, הוספת מפסק קוליברי שהגנו עצמית.
5. פתח את השרירים רצועה (איור 3א') עם מלקחיים בסדר דומונט #5 ו- 7 # דומונט לחשוף סחוס התריס, הסחוס הטבעתי, קנה הנשימה. בלשון בוטה להפריד את קנה הנשימה העצבים בגרון חוזרים ונשנים פועל במקביל משני צדדיו, ואחריה ההפרדה במבניו של חוליות הצוואר הוושט (איור 3ב).
6. באמצעות המחט 20 גרם סמן כירורגי, מכתים את החלק הקדמי של קנה הנשימה.
7. לזהות את קנה הנשימה בחתך מתחת הצלצול השלישי. הסחוס בקנה הנשימה, transect קנה הנשימה באמצעות מספריים האביב Vannas-Tubingen וזוג מלקחיים בסדר דומונט #7. מחזיק את זה עם המלקחיים מעוקל בסדר, לאבטח קנה הנשימה דיסטלי לעצם החזה באמצעות סטרילי 9-0 תפר ניילון כדי ליצור מיכשור וציוד זמניים (איור 3C). הערה: חומר תפרים אלטרנטיביים שיכולים לשמש היא PDS 9-0 עבור reapproximation השרשה ושרירים בקנה הנשימה.
8. עם מחט 20 גרם, סמן כירורגי, כתם השתל לייצג את החלק הקדמי.
9. להשתיל את השתל הוספת צינתור-האחורי, צינתור-צדדי, התפרים proximal הקדמי, הסדר הזה באמצעות תפר ניילון סטרילי 9-0 (איור 3ד'), דומונט #7 עדינים מלקחיים בעל מחט.
10. פונים בעלי חיים ליד ב 180 מעלות כדי למקם את הזנב שלו מן המנתח. שחרר את זמני מיכשור וציוד. קנה הנשימה דיסטלי שהיישום transected כדי להתיר את השימוש של המקטע resected כמו גזע עבור הכחשה. כאשר אין בה צורך, קטע קנה הנשימה של 5 מ מ מוסר לחלוטין.
11. להשלים את ההשקה דיסטלי על-ידי הצבת התפרים בצורה דומה כמו ההשקה הפרוקסימלית.
12. להעריך מחדש את מיקום השתל והשרירים רצועה. סגור את החתך בעזרת תפרים ניילון סטרילי 9-0 בתבנית פועל.
13. מזריקים 0.1 מ"ל של הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously ומניחים את החיה בתוך כלוב ההתאוששות מונחת כרית החימום ללא בעלי חיים אחרים בתוך הכלוב.
14. להתבונן על העכבר עד שזה המודעים והבלתי מודעים, היכולת ambulate, ולאחר מכן העבר את העכבר לכלוב חדש עם מצעים רכים, צ'או לחות ומים תרופות (איבופרופן, 30 מ"ג/ק"ג) במשך 48 שעות. לאחר פרק זמן זה, להחזיר את העכבר כלוב רגיל עם עכברים אחרים.
    הערה: עכברים לשמור על מצוקה נשימתית או ירד פעילות לאחר ההשתלה הם נצפו על ידי צוות המעבדה ו/או בעלי חיים בחממה 32 מעלות צלזיוס. אם זה נמשך יותר מ 48 שעות, ואז העכברים צריך להיות מורדמים.

5. היסטולוגיה ו אימונוהיסטוכימיה

הערה: כתמים Hematoxylin ואאוזין בוצעו באמצעות טכניקה סטנדרטית על-ידי הליבה מורפולוגיה של בית החולים לילדים ארצית. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על פי להלן השלבים.

1. Deparaffinize השקופיות באמצעות 1) קסילן במשך 5 דקות, קסילן 2) במשך 5 דקות, 3) 100% אתנול 5 דקות, 4) 90% אתנול במשך 5 דקות, 5) 70% אתנול ' מזערי ' 5, 6) מזוקקים H₂O (dH₂O) במשך 5 דקות.
2. להטביע את השקופיות במאגר ציטראט ומניחים בסיר לחץ מלא מים. חום במשך 10 דקות ואז להתקרר לטמפרטורת החדר. לשטוף עם אלבומין שור 0.1% ב- PBS (BSA-PBS) עבור 5 דק שטיפה עם dH₂O.
   הערה: חימום יכול להעשות גם עם אמבט מים חמים או במיקרוגל למשך 15 דקות.
3. דגירה של השקופיות עם סרום עז רגיל 3% ב- PBS לשעה בטמפרטורת החדר. תשטוף עם 0.1% BSA-PBS עבור 5 דק דגירה של נוגדן ראשוני עם ריכוזים של קרטין 5 קרטין 14 (1:250)⁶ (1:1000)⁶, ו- F4/80 (1: 100)⁷ עבור 18 h בין לילה ב 4 º C.
4. לשטוף עם 0.1% BSA-PBS פעמיים בשביל 10 דקות כל אחד לשטוף. דגירה עם נוגדן המשני המתאים-ריכוז שבערך K5/K14, 1:300 F4/80 לשעה בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 0.1% BSA-PBS פעמיים בשביל 10 דקות כל אחד לשטוף.
5. הר באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenolindole (דאפי) המכיל הרכבה מדיה וזכוכית שער גולשת. אפשר לשבת במשך 30 דקות לפני הדמיה.

תוצאות

איור 1 מדגימה סכימטי של TETG זריעה, השרשה. מח העצם היה שנקטפו עכברים C57BL/6 ותרבותית במבחנה. BM-MNCs היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גבי TETG. TETGs הזריעה היו מושתלים לתוך עכבר הנמען syngeneic C57BL/6.

איור 2 הו...

Discussion

התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization⁴. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20