A propagação e a implantação de um enxerto traqueal biossintética engenharia de tecido em um modelo do rato

Resumo

Estenose de enxerto representa um obstáculo crítico em substituição de engenharia de tecidos das vias respiratórias. Para investigar os mecanismos celulares subjacentes estenose, utilizamos um modelo murino de substituição traqueal de engenharia de tecidos com células mononucleares de medula semeado (BM-MNC). Aqui, nós detalhe nosso protocolo, incluindo a fabricação de andaime, BM-MNC isolamento, enxerto semeadura e implantação.

Resumo

Opções de tratamento para defeitos traqueais de segmento longo congênita ou secundária têm sido historicamente limitadas devido a uma incapacidade para substituir o tecido funcional. Engenharia de tecidos é uma grande promessa como uma solução em potencial com a sua capacidade de integrar células e moléculas sinalizadoras em um andaime de 3-dimensional. Trabalho recente com enxertos traqueal de engenharia de tecidos (TETGs) tem visto algum sucesso, mas sua tradução tem sido limitada pela estenose do enxerto, colapso do enxerto e atrasou a epitelização. A fim de investigar os mecanismos de condução destas questões, nós desenvolvemos um modelo do rato para implante de prótese traqueal de engenharia de tecidos. TETGs foram construídos usando electrospun polímeros polietileno tereftalato (PET) e poliuretano (PU) em uma mistura de PET e PU (20:80 peso por cento). Andaimes foram semeadas em seguida usando células mononucleares de medula óssea isoladas da semana de 6-8-velhos camundongos C57BL/6 por centrifugação gradiente. 10 milhões de células por enxerto foram semeados para o lúmen do cadafalso e permitidos para incubar durante a noite antes da implantação entre os terceiros e sétimo traqueais anéis. Estes enxertos foram capazes de recapitular os achados de estenose e atrasado epitelização como demonstrado pela análise histológica e a falta de células epiteliais basais 5 de queratina e queratina 14 na imunofluorescência. Este modelo vai servir como uma ferramenta para a investigação de mecanismos celulares e moleculares envolvidos na remodelação de anfitrião.

Introdução

Defeitos de longo-segmento traqueais podem apresentar como condições congênitas raras como anéis traqueais completas e agenesia traqueal, bem como trauma, malignidade e infecção. Quando superior a 6 cm em adultos ou 30% do comprimento traqueal em crianças, esses defeitos não podem ser tratados pela reconstrução cirúrgica. Tentativas de substituir as vias aéreas com tecidos autólogos, transplantes cadavéricos e construções artificiais tem sido atormentadas por infecção crônica, granulação, falha mecânica e estenose.

Engenharia de tecidos traqueais enxertos (TETGs) potencialmente podem resolver esses problemas, evitando a necessidade de imunossupressão para toda a vida. Na última década, TETGs foram testados em modelos animais e utilizados clinicamente em raros casos de uso compassivo^1,2,3. Em estudos clínicos e grandes com animais, recuperação pós-operatória da engenharia de tecidos das vias respiratórias substituição necessárias numerosas intervenções de combate estenose (definida como > 50% de estreitamento luminal) e manter a patência das vias aéreas. Trabalho adicional TETG tem procurado reduzir esta estenose através de avaliar o papel da célula semeadura escolha, vascularização e design de andaime. Escolhas de semeadura de célula e design de andaime vista restaurar a traqueia nativo estrutura/função tem sido focados principalmente em células epiteliais respiratórias e condrócitos semeados em vários andaimes reabsorvíveis, não-absorvíveis e decellularized. Como vascularização provavelmente desempenha um papel importante no desenvolvimento da estenose, outros grupos têm-se centrado na otimização em vitro ou heterotópico modelos para agilizar a revascularização ou neoangiogênese⁴. No entanto, alcançar sucesso vascularização, mantendo também um mecânico competente e funcional TETG permanece um desafio. Apesar dos avanços recentes, minimizando a estenose permanece um obstáculo crítico-tradução clínica.

Para investigar esta resposta histopatológica TETG implantação na vivo, desenvolvemos um modelo de ovino de substituição traqueal de engenharia de tecidos. O enxerto era composto por um misto de polietileno tereftalato (PET) e andaime de electrospun do poliuretano (PU) inoculado com células mononucleares da medula óssea-derivado (BM-PTM). Nesta pequena coorte, demonstrámos que semeado autólogas BM-MNCs aceleraram a re-epitelização e atrasou a estenose⁵. Embora a semeadura com autólogo BM-MNCs melhoradas de sobrevivência, o mecanismo celular pelo qual BM-MNCs modulam a formação de neotissue funcional permanece obscuro.

Investigação sobre o desenvolvimento necessário nível celular de um modelo murino de tecido projetado substituição traqueal. Semelhante ao estudo de ovinos, utilizamos um andaime de electrospun PET:PU semeado com BM-MNCs. consistente com o modelo de ovino, estenose TETG desenvolvido ao longo das duas primeiras semanas após a implantação^{1,2,3 ,5}. Isto sugere que o modelo murino recapitulada a patologia observada anteriormente, permitindo-nos ainda mais, interrogar os mecanismos celulares subjacentes estenose das vias aéreas.

Neste relatório, detalhamos nosso protocolo para engenharia de tecidos traqueal substituição no modelo do rato, incluindo a fabricação de andaime, isolamento BM-MNC, enxerto de semeadura e implantação (Figura 1, Figura 2).

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) no Hospital de crianças em todo o país e institucional Cuidado Animal.

1. fabricação de andaime

1. Preparar uma solução de precursor de nanofibras de polímero por: 1) dissolução 8 wt % PET em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol e aquecimento a 60 ° C e a solução dissolvendo 2) 3 wt % PU em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol à temperatura ambiente.
2. Uma vez arrefecido, combine as soluções para criar uma mistura de polímero final de PET e PU (20:80).
3. Electrospin a solução de PET+ PU sobre uma haste de aço inoxidável (diâmetro de 1 mm), utilizando uma agulha de ponta romba de 20 G em uma seringa de 60 mL cheia com a solução de PET:PU usando um conjunto de abastecimento de energia DC alta tensão a + 14 kV na agulha, outra alimentação de DC de alta tensão fornecer conjunto de -3 kV , uma taxa de fluxo de 5 mL/h e a uma distância de ponta-a-substrato de 20 cm. Gire a haste a 350 rpm durante depoimento de fibra.
4. Continue a eletrofiação até alcançar a espessura de parede de andaime desejado de 300 µm. Deslize o andaime fora a haste, então segure sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente residual.
5. Esterilize o andaime usando uma dosagem de luz ultravioleta de 350 mJ/cm² antes da implantação.

2. medula óssea-derivado células mononucleares (BM-MNC) colheita

1. Eutanásia em um 6-8 semanas rato velho, feminino, C57BL/6, com um coquetel de cetamina (200 mg/kg), xilazina (20 mg/kg) e cetoprofeno (10 mg/kg). Seleção para eutanásia completa pelo método de cauda-pitada. Certifique-se de seguir diretrizes locais para eutanásia.
2. Sob condições estéreis, retire a pele do fêmures e tíbias para expor o osso usando fina tesoura e pinça Adson-micro. Use Dumont #5 pinças e pinças de Dumont #5/45 para remover a fáscia e os tendões. Separar os ossos e corte cada um em ambas as extremidades. Usando uma seringa de 5 mL e uma agulha 25g, irrigue a medula óssea em uma placa de Petri contendo 30 mL de mídia Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Filtre esta RPMI com medula óssea através de um filtro de célula de nylon µm 70 em um tubo de 50 mL.
3. Um armário de biossegurança, coloque 5 mL de diatrizoate de polysurcrose e de sódio em um tubo de 15 mL. Delicadamente adicione o RPMI contendo células mononucleares de medula óssea para baixo do lado do tubo para evitar a mistura das duas camadas. Centrifugar a 461 x g durante 30 min com "freio 1" a 24 ° C.
   Nota: Na nossa centrífuga, freio 1 defende o máximo de tempo esgotado tempo durante a desaceleração.
4. Fora as três camadas formadas, descartar a camada superior (rosa) do plasma e recolher a camada média (clara), consistindo de células mononucleares da medula óssea. Descarte o precipitado de células vermelhas do sangue.
5. Diluir as células mononucleares da medula óssea (BM-MNC) na salina tamponada fosfato (PBS), em uma proporção 1:1 e centrifugar 461 x g por 10 min com "freio 9" a 24 ° C.
6. Remover o sobrenadante e diluir a pelota com 5 mL de PBS. Centrifugar a 461 x g por 10 min com "freio 9" a 24 ° C.
7. Remover o sobrenadante e diluir a pelota com ~ 10 mL de RPMI.
8. Dilua 10 µ l da solução BM-MNC com igual volume de 0,4% trypan azul em um tubo de 1 mL. Lugar de 10 µ l da solução em uma célula slide câmara de contagem. Conte as células usando um contador automatizado de células. Repita a etapa e calcular o número médio de células.
   Nota: Uma contagem de 1 X 10⁸ células células média foi obtida com o uso de dois ratos de doador. Isto seria equivalente a dois fêmures, e duas tíbias que medula óssea é isolado de.
9. Centrifugar a solução BM-MNC em 461 x g durante 10 minutos com o "Freio 9" a 24 ° C. Remover o sobrenadante e diluir a concentração de células para 10⁷ células/enxerto.
   Nota: Temos estudado a semeadura eficiência entre 1, 10 e 100 milhões de células e encontrado que 10 milhões de células por enxerto produz a mais alta eficiência de semeadura.

3. célula propagação nos enxertos

1. Medir os comprimentos dos andaimes e se necessário, recortá-los para um comprimento de 5 mm.
2. Pre-molhado o andaime com 5 µ l de RPMI 5 min. Retire o RPMI.
3. Adicione 5 µ l da solução BM-MNC para o lúmen do cadafalso por 10 min.
4. Passe uma agulha 21G através do lúmen da prótese e incubar o enxerto em 1000 µ l de RPMI durante a noite a 37 ° C, em uma incubadora.

4. implantação do enxerto

Nota: Tenha cuidado para manter a técnica asséptica durante o procedimento de implantação de enxerto.

1. Use camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8-semanas como destinatários para os enxertos de célula semeado. Enrofloxacina (10mg/kg) por via subcutânea injete 24 h antes da cirurgia e apenas antes da incisão.
2. Pesar o mouse e administrar uma dose de 0,1 mL/10g do coquetel anestésico cetamina (100 mg/kg), xilazina (10mg/kg) e cetoprofeno (5 mg/kg) como analgesia intraperitonealmente.
3. Verifica se o plano da anestesia foi alcançado pelo método de cauda-pitada. Confirmando o nível de sedação, aplicar uma pomada oftálmica estéril para os olhos e cortar o cabelo no local da cirurgia do queixo de clavículas. Coloque o animal em uma almofada em uma posição reclinada dorsal. Desinfecte o local cirúrgico usando primeiro uma almofada da preparação do iodo-povidona, seguido por uma almofada da preparação do álcool (álcool a 70%) e mais uma vez uma almofada da preparação do iodo-povidona.
4. Coloque o animal ao microscópio dissecação com a cabeça longe o cirurgião. Fazer uma incisão mediana desde as clavículas até o osso hioide, com a ajuda de uma tesoura bem e micro-Adson fórceps. Limpe a fáscia com Dumont #5 e a pinça fina Dumont #7, juntamente com um cotonete estéril, se necessário e inserir um retractor de Colibri auto retenção.
5. Abra os músculos da cinta(Figura 3)com a pinça fina Dumont #5 e #7 de Dumont para expor a cartilagem tireoide, a cartilagem cricoide e traqueia. Sem rodeios, separe a traqueia os nervos laríngeos recorrentes paralela em ambos os lados, seguido por separação circunferencial da traqueia do esôfago (Figura 3B).
6. Usando uma agulha 20g e marcador cirúrgico, manche a porção anterior da traqueia.
7. Identificar a traqueia e fazer uma incisão abaixo do terceiro anel de cartilagem traqueal e transecto da traqueia usando um par de tesoura de Vannas-Tubingen primavera e um par de pinças bem Dumont #7. Segurá-la com a pinça curva bem, segura a traqueia distal ao esterno usando estéril sutura de nylon 9-0 para criar uma traqueostomia temporária (Figura 3C). Nota: Um material de sutura alternativo que pode ser usado é o PDS de 9-0 para a reaproximação de implantação e músculo traqueal.
8. Com uma agulha de 20G e um marcador cirúrgico, mancha o enxerto para representar a porção anterior.
9. Implante de prótese inserção proximal-posterior, lateral proximal e suturas proximal-anterior, nessa ordem, usando sutura de nylon estéril de 9-0 (Figura 3D), Dumont #7 multa fórceps e um porta-agulha.
10. Transformar o animal 180° para colocar sua cauda longe o cirurgião. Lançamento da traqueostomia temporária. A traqueia distal incompleta é seccionada para permitir o uso do segmento ressecado como um toco de retração. Quando não mais necessário, o segmento de traqueia de 5mm é removido completamente.
11. Complete a anastomose distal, colocando as suturas de moda semelhante como a anastomose proximal.
12. Re-aproximar a posição de enxerto e músculos. Feche a incisão utilizando suturas de estéril de nylon 9-0 em um padrão de execução.
13. Injetar 0,1 mL de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea e colocar o animal em uma gaiola de recuperação colocada sobre uma almofada de aquecimento sem outros animais na gaiola.
14. Observe o mouse até que seja consciente e capaz de deambular e, em seguida, transferir o mouse para uma gaiola nova com fundamento macio, húmida comida e água medicamentoso (Ibuprofeno, 30 mg/kg) por 48 h. Após este período de tempo, retorne o mouse para uma gaiola normal com outros ratos.
    Nota: Ratos que mantêm respiratória ou diminuição da atividade após o implante são observados pela equipe do laboratório e/ou animal em uma incubadora de 32 ° C. Se isto continua por mais de 48 h, os ratos devem ser sacrificados.

5. histologia e imunohistoquímica

Nota: As manchas de hematoxilina e eosina foram realizadas utilizando a técnica padrão pelo núcleo de morfologia de Hospital de crianças em todo o país. Imuno-histoquímica foi realizada de acordo com as etapas a seguir.

1. Deparaffinize os slides usando 1) xileno por 5 min, 2) xileno por 5 min, 3) 100% de etanol para 5 min, 4) 90% etanol por 5 min, 5) 70% de etanol por 5 min, 6) destilada H₂O (dH₂O) por 5 min.
2. Mergulhe os slides em tampão citrato e coloque na panela de pressão cheia de água. Aqueça por 10 min, em seguida, deixar arrefecer à temperatura ambiente. Lavar com albumina de soro bovino 0,1% em PBS (BSA-PBS) 5 min. enxaguar com dH₂O.
   Nota: O aquecimento também pode ser feito com um banho de água quente ou microondas por 15 min.
3. Incube as lâminas com 3% de soro de cabra normal em PBS por 1h à temperatura ambiente. Lave com 0,1% BSA-PBS durante 5 min. Incubar em anticorpo primário com concentrações de queratina, 5 (1: 1000)⁶, queratina 14 (1: 250)⁶ e F4/80 (1: 100)⁷ para 18 h durante a noite a 4 ° C.
4. Lavar com 0,1% BSA-PBS duas vezes por 10 min cada lavagem. Incube com anticorpo secundário apropriado na concentração de 1: 500 para K5/K14 e 1: 300 F4/80 por 1h à temperatura ambiente. Lavar com 0,1% BSA-PBS duas vezes por 10 min cada lavagem.
5. Montagem utilizando 4' 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) contendo montagem mídia e vidro lamínulas. Deixe para descansar por 30 min antes de imagem.

Resultados

A Figura 1 ilustra um esquema de TETG semeadura e implantação. Medula óssea de camundongos C57BL/6 foi colhida e cultivadas em vitro. BM-MNCs foram isoladas por centrifugação densidade e propagadas para o TETG. TETGs semeados foram implantados em um rato de destinatário C57BL/6 syngeneic.

A Figura 2 é uma visão geral sobre o andaime TETG PET:PU processo...

Discussão

Desenvolvimento de um modelo de mouse para tracheas de engenharia de tecidos é essencial para compreender os fatores que têm limitado a tradução clínica dos TETGs; ou seja, colapso de enxerto, estenose e epitelização atrasada⁴. Alguns fatores que contribuem para estas limitações incluem a seleção do material de enxerto, processo de fabricação, projeto de andaime e célula semeadura protocolos. Este modelo permite a avaliação mais rápida desses fatores para compreender os mecanismos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20