小鼠模型中生物合成组织工程气管移植的育苗与植入

摘要

接枝狭窄是组织工程气道置换术的关键障碍。为了研究狭窄的细胞机制, 我们利用组织工程气管替代种子骨髓单个核细胞 (BM-MNC) 的小鼠模型。在这里, 我们详细介绍了我们的协议, 包括支架制造、BM-MNC 隔离、接枝播种和植入。

摘要

先天性或继发性长段气管缺损的治疗选择历来有限, 因为无法替换功能性组织。组织工程作为一种潜在的解决方案, 具有很大的希望, 它能够将细胞和信号分子整合到三维支架中。最近的工作与组织工程气管移植 (Ttg) 已经取得了一些成功, 但他们的翻译已受到限制的移植狭窄, 移植物塌陷, 和延迟上皮化。为了研究这些问题的驱动机制, 我们开发了一个组织工程气管移植的小鼠模型。Ttg 是用电纺聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 和聚氨酯 (PU) 在 PET 和 PU (20:80 的重量) 的混合物中构建的。然后用梯度离心法从6-8 龄的 c57bl6 小鼠身上分离出骨髓单个核细胞来播种支架。每个移植细胞被播种到支架的腔上, 并允许在第三和第七个气管环之间植入前孵育一夜。这些移植能够重述狭窄和延迟上皮化的结果, 表现在组织学分析和缺乏角蛋白5和角蛋白14基础上皮细胞的免疫荧光。该模型将作为研究宿主重塑所涉及的细胞和分子机制的工具。

引言

长段气管缺损可表现为罕见的先天性疾病, 如完整的气管环和气管形成, 以及创伤, 恶性肿瘤和感染。成人超过6厘米或儿童气管长度的30% 时, 这些缺陷不能通过手术重建来治疗。试图用自体组织、尸体移植和人工结构取代气道的努力一直受到慢性感染、造粒、机械衰竭和狭窄的困扰。

组织工程气管移植 (Ttg) 可以潜在地解决这些问题, 同时避免终身免疫抑制的需要。在过去的十年里, ttg 已经在动物模型中进行了测试, 并在罕见的同情使用^1,2,3的情况下临床上得到了应用。在临床和大型动物研究中, 术后从组织工程气道置换术中恢复需要采取多种干预措施, 以对抗狭窄 (定义为 gt;50), 并保持气道通畅。此外, TETG 的工作还试图通过评估细胞播种选择、血管化和支架设计的作用来减少这种狭窄。细胞播种选择和支架设计旨在恢复原生气管结构功能的主要重点是呼吸上皮细胞和在各种可吸收、不可吸收和脱细胞的支架上播种的软骨细胞。由于血管化可能在狭窄的发展中发挥主要作用, 其他群体则专注于优化体外或异位模型, 以加快血运重建或新生血管生成⁴。然而, 在保持机械能力和功能性的 TETG 的同时实现成功的血管化仍然是一项挑战。尽管最近取得了进展, 但最大限度地减少狭窄仍然是临床翻译的一个关键障碍。

为了研究这种组织病理学对 TETG 植入在体内的反应, 我们开发了组织工程气管置换术的牛模型。接枝由混合聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 和聚氨酯 (PU) 电纺支架组成, 该支架由骨髓衍生的单核细胞 (Bm-mnc) 播种。在这个小队列中, 我们证明了种子自体 Bm-mc 加速再上皮化和延迟狭窄 5.虽然自体 Bm-mnc 播种提高了存活率, 但骨髓-mnc 调节功能新组织形成的细胞机制尚不清楚。

对细胞水平的研究需要开发一个小鼠模型的组织工程气管置换。与牛的研究类似, 我们使用了 pet: pu 电纺脚手架, 用 bm-mnc 播种. 与牛模型^一致, ttg 狭窄是在植入后的前两周内发展起来的, 植入 1^,2^{,3 ,5}。这表明, 小鼠模型重述了以前观察到的病理, 使我们能够进一步询问气道狭窄背后的细胞机制。

在本报告中, 我们详细介绍了组织工程气管置换在小鼠模型中的协议, 包括支架制造、BM-MNC 隔离、移植物播种和植入 (图 1,图 2)。

研究方案

这里描述的所有方法都得到了全国儿童医院动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。

1. 脚手架制造

1. 通过以下方式制备聚合物纳米纤维前体溶液: 1) 在 1, 1, 1, 1, 3, 3, 3, 六氟异丙醇中溶解 8 wt% PET, 并将溶液加热到 60°c, 并在室温下通过 2) 在 1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟异丙醇中溶解 3 wt% pu。
2. 冷却后, 将溶液结合使用, 形成 pet 和 PU 的最终聚合物混合物 (20:80)。
3. 电旋转 PET + PU 解决方案到不锈钢棒 (1 毫米直径) 上使用20G 钝尖针在60毫升注射器上充满 pet: PU 解决方案使用高压直流电源设置为 + 14kv 的针, 另一个高压直流电源设置为-3 kV, 5 mlh 流速, 和20厘米的倾角到基板的距离。在纤维沉积过程中, 以350转/分旋转杆。
4. 继续电纺, 直到达到所需的支架壁厚300μm。将脚手架从棒上滑落, 然后将其固定在真空下过夜, 以去除任何残留的溶剂。
5. 植入前使用 350 mjcm 2 的紫外线剂量对支架进行消毒.

2. 骨髓源性单个核细胞 (BM-MNC) 采集

1. 将6-8 大的雌性, c57bl6 小鼠与氯胺酮 (200 mg/kg)、xylazine (20 mg kg) 和 ketoproen (10 mg kg) 的鸡尾酒一起安乐死。用尾夹紧法检查是否有完全的安乐死。一定要遵循当地的安乐死指南。
2. 在无菌条件下, 使用精细剪刀和微型 adson 钳子去除股骨的皮肤和带蒂, 以露出骨骼。使用 Dumont #5 钳子和 Dumont #5/45 钳子切除筋膜和肌腱。把骨头分开, 把每一个骨头的两端都剪掉。使用5毫升注射器和25G 针, 在含有罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基30毫升的培养皿中冲洗骨髓。用骨髓将此 RPMI 通过70μm 尼龙电池过滤器过滤成50毫升管。
3. 在生物安全柜中, 将5毫升的聚超和二甲酸钠放入15毫升的管中。轻轻加入含有骨髓单个核细胞的 RPMI, 沿着试管的一侧, 以避免混合两层。在 461 x g的温度下离心 30分钟, 24°c 时使用 "制动 1"。
   注: 在我们的离心机上, 制动1代表减速期间最长的运行时间。
4. 在形成的三层中, 丢弃血浆的顶层 (粉红色), 收集由骨髓单个核细胞组成的中间层 (透明) 层。丢弃红血球的沉淀。
5. 将磷酸盐缓冲盐 (pbs) 中的骨髓单个核细胞 (BM-MNC) 以12:1 的比例稀释, 以 461 x g 的比例稀释离心机 10分钟 , 24°c 时使用 "制动 9"。
6. 用5毫升的 PBS 去除上清液, 稀释颗粒。在 461 x g的温度下离心 10分钟, 24°c 时使用 "制动 9"。
7. 用 ~ 10 毫升的 RPMI 去除上清液, 稀释颗粒。
8. 在 1 mL 管中稀释 BM-MNC 溶液的 10Μl, 其相同体积为0.4% 的色氨蓝色。将溶液的10Μl 放置在细胞计数室滑梯中。使用自动单元格计数器对单元格进行计数。重复此步骤并计算单元格的平均数量。
   注: 使用两只供体小鼠平均可获得 1 X 10^8个细胞。这相当于两个股骨, 和两个组织, 骨髓被分离。
9. 以 461 x g离心 BM-MNC 溶液 10分钟, 24°c 时使用 "制动 9"。去除上清液, 将细胞浓度稀释至 10^{7 细胞}移植。
   注: 我们研究了 1, 1000万和1亿个细胞的播种效率, 发现每一个接枝产生的 1, 000万个细胞的播种效率最高。

3. 在移植物上播种的细胞

1. 测量脚手架的长度, 如果需要, 将其切割成5毫米的长度。
2. 用 5μl RPMI 预湿脚手架 5分钟. 取出 RPMI。
3. 在支架的腔内加入5Μl 的 bm-mnc 溶液, 时间为10分钟。
4. 通过移植器的腔传递21g 针, 在37°c 的孵化器中在 1000Μl RPMI 中孵育移植。

4. 植入物

注: 在移植过程中, 应注意保持无菌技术。

1. 使用6-8 大的雌性 c57bl6 小鼠作为细胞种子移植的接受者。术前24小时和切口前注射恩罗沙星 (10mg/kg)。
2. 称重小鼠, 并以 0.1 mlp 剂量的氯胺酮 (100 mL/10)、xylazine (10mg/kg) 和酮洛芬 (5mgkg) 为镇痛剂, 作为腹腔内的镇痛剂。
3. 检查麻醉平面是否通过尾夹紧法实现。在确认镇静水平时, 将无菌的眼药膏涂在眼睛上, 并将手术部位的头发从下巴剪到锁骨。将动物放在背侧卧位的垫子上。首先使用 povidone-iodine 准备垫, 然后使用酒精准备垫 (70% 的酒精), 再使用 povidone-iodine 准备垫对手术部位进行消毒。
4. 将动物放在解剖显微镜下, 头部远离外科医生。在精细剪刀和微型 adson 钳的帮助下, 做一个中线切口, 从锁骨到舌骨不等。用 Dumont #5 和 Dumont 清洁筋膜 #7 细钳, 以及无菌棉签 (如果需要), 并插入自固定的 Colibri 牵引器。
5. 用 Dumont #5 和 Dumont 打开表带肌肉 (图 3a) #7 精细的钳子, 以暴露甲状腺软骨、环状软骨和气管。将气管与两侧平行运行的喉返神经中模糊分离, 然后从食道周围分离气管 (图 3b)。
6. 使用20G 针和手术标记, 弄脏气管的前部。
7. 识别气管, 并在第三个气管软骨环下方做一个切口, 并使用一把 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀和一把 Dumont #7 细钳横切气管。用精细的弯曲钳固定它, 使用无菌9-0 尼龙缝合将气管远端固定到胸骨, 以创建一个临时气管造口术 (图 3c)。注: 可用于气管植入和肌肉重绘的替代缝合材料是 9-0 PDS。
8. 用20G 针和手术标记, 染色移植物, 以代表前部。
9. 植入移植插入近后、近侧和近前缝合线的移植物, 按顺序使用9-0 无菌尼龙缝合线 (图 3d), dumont #7 细钳和针座。
10. 转动动物 180°, 使其尾巴远离外科医生。松开临时气管造口术。远端气管被完全横切, 以允许使用切除的段作为一个树桩的收回。当不再需要时, 5 MM 气管段被完全删除。
11. 完成远端吻合, 将缝合线放置在类似于近端吻合的方式。
12. 重新近似移植位置和表带肌肉。用9-0 无菌尼龙缝合线在跑步模式下关闭切口。
13. 皮下注射0.1 毫升丁丙诺非 (0.1 mgskg), 并将动物放置在放在加热垫上的恢复笼中, 而没有其他动物在笼子中。
14. 观察鼠标, 直到它是有意识的, 并能够移动, 然后转移到一个新的笼子与柔软的床上用品, 潮湿的食物和药用的水 (布洛芬, 30 mg kg) 48小时。在此时间段后, 将鼠标与其他鼠标返回到正常的笼子。
    注: 实验室和动物工作人员在32°c 的孵化器中观察到植入后维持呼吸窘迫或活动减少的小鼠。如果这种情况持续超过 48小时, 那么老鼠就应该被安乐死。

5. 组织学和免疫组化

注: 血液氧西林和 eosin 污渍是使用标准技术进行全国儿童医院形态核心。免疫组织化学是按照以下步骤进行的。

1. 使用 1) 二甲苯 5分钟, 2) 二甲苯 5分钟, 3) 100% 乙醇 5分钟, 4) 90% 乙醇 5分钟, 5分钟, 5) 70% 乙醇 5分钟, 6) 蒸馏_h2o (dh 2 o₎5分钟。
2. 将滑块浸入柠檬酸缓冲液中, 放入充水高压锅中。加热 10分钟, 然后冷却到室温。用0.1% 的牛血清白蛋白在 PBS (BSA-PBS) 中清洗 5分钟, 用 Dh2o_冲洗。
   注: 客人还可以使用热水浴池或微波炉加热15分钟。
3. 在室温下, 用3% 正常山羊血清在 PBS 中进行1小时的切片。用 0.1% BSA-PBS 在原代抗体中清洗 5分钟, 其浓度为角蛋白 5 (1:1000)⁶、角蛋白 14 (1:1000)⁶和 f4\ 80 (1: 100) 7, 在4°c 过夜 18小时.
4. 用 0.1% BSA-PBS 清洗两次, 每次清洗10分钟。在室温下, 用适当的二级抗体在 k这儿 k14 浓度为1:500 和 1:300 fn 80 时, 以1小时的浓度进行培养。用 0.1% BSA-PBS 清洗两次, 每次清洗10分钟。
5. 安装使用 4 ', 6-二胺-2-苯二酚 (DAPI), 包含安装介质和玻璃盖滑块。在成像前允许坐30分钟。

结果

图 1显示了 tetg 播种和植入的示意图。从 c57bl6 小鼠身上采集骨髓, 并进行体外培养。采用密度离心分离的 Bm-mnc, 并在 TETG 上播种。将选择的 Ttg 植入共形 c57bl6 受体小鼠体内。

图 2是 PET:PU ttag 脚手架制造工艺的概述。PET:PU 溶液电纺到20G 钝针上, 以达到最终 TETG 壁厚300μm 和流?...

讨论

开发组织工程气管的小鼠模型对于了解临床翻译限制的因素至关重要;即移植物塌陷、狭窄和延迟上皮化⁴。造成这些限制的几个因素包括接枝材料的选择、制造工艺、支架设计和细胞播种协议。该模型可以更快地评估这些因素, 以便了解影响它们的细胞和分子机制。

我们在这里展示了上皮细胞的存在 (图 4), 以及模型重述移植狭窄的能力...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20