Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Resumen

Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.

Resumen

Opciones de tratamiento para los defectos traqueal congénita o secundaria larga del segmento históricamente han limitado debido a una incapacidad para reemplazar tejido funcional. Ingeniería de tejidos es muy prometedor como una posible solución con su capacidad para integrar las células y moléculas de señalización en un andamio de 3 dimensiones. Trabajo reciente con ingeniería tisular traqueal injertos (TETGs) ha visto cierto éxito, pero su traducción ha estado limitada por la estenosis del injerto, injerto el colapso y retrasa la epitelización. Con el fin de investigar los mecanismos de conducción de estas cuestiones, hemos desarrollado un modelo de ratón para la implantación de prótesis traqueal de ingeniería tisular. TETGs fueron construidos usando electrospun polímeros polietileno tereftalato (PET) y poliuretano (PU) en una mezcla de PET y PU (20:80 peso de por ciento). Andamios entonces fueron sembrados utilizando células mononucleares de médula ósea aisladas de 6-8 semanas-viejos ratones C57BL/6 por centrifugación del gradiente. 10 millones de células por injerto fueron sembradas en el lumen del andamio y permitir incubar durante la noche antes de la implantación entre el tercer y séptimo traqueal. Estos injertos eran capaces de recapitular los resultados de la estenosis y retrasa la epitelización según lo demostrado por análisis histológico y la falta de queratina 5 y 14 de queratina las células epiteliales basales en la inmunofluorescencia. Este modelo servirá como una herramienta para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la remodelación de la sede.

Introducción

Defectos traqueales de segmento largo se presentan como condiciones congénitas raras como anillos traqueales completos y agenesia traqueal, así como traumatismo, malignidad e infección. Cuando superior a 6 cm en adultos o 30% de la longitud traqueal en niños, estos defectos no pueden ser tratados por la reconstrucción quirúrgica. Intentos de sustituir las vías respiratorias con tejido autólogo, trasplante cadavérico y construcciones artificiales han sido plagados por infección crónica, granulación, falla mecánica y la estenosis.

Ingeniería tisular traqueales injertos (TETGs) potencialmente pueden abordar estos problemas, evitando la necesidad de inmunosupresión de por vida. En la última década, TETGs han sido probadas en modelos animales y utilizado clínicamente en raras ocasiones de uso compasivo^1,2,3. En estudios animales tanto y grandes, recuperación postoperatoria de reemplazo de ingeniería tisular de la vía aérea requiere numerosas intervenciones a la estenosis de combate (definido como > enangostar luminal de 50%) y mantener la permeabilidad de las vías respiratorias. Trabajo adicional del TETG ha intentado reducir la estenosis a través de la evaluación de la función de célula siembra elección, vascularización y diseño de andamios. Andamio diseño dirigido a restaurar la tráquea nativa estructura/función y opciones de siembra de células se han enfocado principalmente en las células epiteliales respiratorias y condrocitos sembrados en varios andamios reabsorbibles y no reabsorbibles y decellularized. Como vascularización probablemente juega un papel importante en el desarrollo de estenosis, otros grupos se han centrado en optimizar en vitro o heterotópicos modelos para agilizar la revascularización o neoangiogenesis⁴. Sin embargo, lograr éxito vascularización manteniendo también un TETG mecánicamente competente y funcional sigue siendo un desafío. A pesar de los avances recientes, minimizando la estenosis sigue siendo un obstáculo crítico para la traducción clínica.

Para investigar la respuesta histopatológica a TETG implantación en vivo, hemos desarrollado un modelo ovino de ingeniería tisular reemplazo traqueal. El injerto fue compuesto de una mezcla de polietileno tereftalato (PET) y poliuretano andamio de electrospun (PU) sembrado con células mononucleares de médula ósea (BM-multinacionales). En esta cohorte pequeña, demostramos que empresas multinacionales BM autólogas sembradas aceleraron la reepitelización y retrasó estenosis⁵. Aunque la siembra con autólogo BM-multinacionales mejoradas la supervivencia, el mecanismo celular por el cual BM-MNCs modulan la formación de neotissue funcional sigue siendo confuso.

Investigación sobre el desarrollo requiere nivel celular de un modelo murino de tejido había diseñado reemplazo traqueal. Similar al estudio ovino, utilizamos un andamio de electrospun PET:PU con BM-MNCs. en concordancia con el modelo ovino, estenosis TETG desarrollado a lo largo de las dos primeras semanas tras la implantación^{1,2,3 ,5}. Esto sugiere que el modelo murino recapituló la patología observada anteriormente, permitiéndonos además interrogar los mecanismos celulares subyacentes a la estenosis de la vía aérea.

En este informe, detallamos nuestro protocolo para ingeniería de tejidos reemplazo traqueal en el modelo de ratón incluyendo la fabricación de andamios, aislamiento BM-MNC, injerto siembra e implantación (figura 1, figura 2).

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital de niños en todo el país.

1. fabricación de andamios

1. Preparar una solución de precursor de nanofibras de polímeros por: 1) disolver 8 wt % PET 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol y calentar la solución a 60 ° C y disolviendo 2) 3% wt PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol a temperatura ambiente.
2. Una vez enfriado, se combinan las soluciones para crear una mezcla final del polímero de PET y PU (20:80).
3. Electrospin la solución PU PET+ en una varilla de acero inoxidable (1 mm de diámetro) utilizando una aguja de punta Roma de 20 G en una jeringa de 60 mL llena con la solución de PET:PU utilizando un juego de suministro eléctrico de alto voltaje DC a + 14 kV en la aguja, otra corriente de alto voltaje de la fuente conjunto a -3 kV , un caudal de 5 mL/h y una distancia de punta a substrato de 20 cm. Gire la varilla a 350 rpm durante la deposición de la fibra.
4. Continuar electrospinning hasta logra el espesor deseado andamio de 300 μm. Deslice el andamio de la varilla, luego sostenga bajo vacío durante la noche para quitar cualquier solvente residual.
5. Esterilizar el andamio con una dosis de luz ultravioleta de 350 mJ/cm² antes de la implantación.

2. médula ósea de células mononucleares (MNC-BM) cosecha

1. Eutanasia a un 6-8 semanas ratón viejo, mujer, C57BL/6 con un cóctel de ketamina (200 mg/kg) y xilacina (20 mg/kg), ketoprofeno (10 mg/kg). Compruebe la eutanasia completa por el método de cola-pinch. Asegúrese de seguir las pautas locales para eutanasia.
2. Bajo condiciones estériles, retirar la piel sobre los fémures y tibias para exponer hueso con tijeras finas y pinzas de Adson micro. Use pinzas Dumont #5 y pinzas Dumont #5/45 para quitar la fascia y los tendones. Separar los huesos y cortar cada uno de ellos en los extremos. Usando una jeringa de 5 mL y una aguja de 25G, lavar la médula ósea en una placa Petri que contiene 30 mL de medio de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Filtrar esta RPMI con médula ósea a través de un tamiz de celular 70 μm de nylon en un tubo de 50 mL.
3. En un gabinete de bioseguridad, coloque 5 mL de polysurcrose y sodio Diatrizoato en un tubo de 15 mL. Suavemente agregar el RPMI conteniendo las células mononucleares de médula ósea por el lado del tubo para evitar la mezcla de las dos capas. Centrífuga a 461 x g por 30 min con "freno de 1" a 24 ° C.
   Nota: En nuestra centrífuga, soportes de freno 1 para el más largo ejecutan a tiempo durante la desaceleración.
4. De las tres capas formadas, descartar la capa superior (rosa) de plasma y recoger la capa del medio (clara) que consiste en las células mononucleares de médula ósea. Descarte el precipitado de células de sangre rojas.
5. Diluir las células mononucleares de la médula (BM-MNC) en tampón fosfato salino (PBS) en una proporción 1:1 y centrifugar a 461 x g por 10 min con "freno de 9" a 24 ° C.
6. Quite el sobrenadante y diluir el sedimento con 5 mL de PBS. Centrífuga a 461 x g por 10 min con "freno de 9" a 24 ° C.
7. Quite el sobrenadante y diluir el sedimento con ~ 10 mL de RPMI.
8. Diluir 10 μl de la solución de BM-multinacional con un volumen igual de tripano 0.4% azul en un tubo de 1 mL. Lugar 10 μl de la solución en una celda de diapositivas cámara de conteo. Contar las células usando un contador de células automatizado. Repita el paso y calcular el número medio de células.
   Nota: Un recuento celular promedio de 1 X 10⁸ células se obtuvo de la utilización de dos ratones de donantes. Esto sería equivalente a dos fémur y dos tibias que la médula del hueso se aísla de.
9. Centrifugue la solución BM-MNC a 461 x g por 10 min con el "Freno de 9" a 24 ° C. Quite el sobrenadante y diluir la concentración de células a 10⁷ células/injerto.
   Nota: Hemos estudiado la siembra rendimiento entre 1, 10 y 100 millones de células y encontró que 10 millones de células por injerto produce la mayor eficiencia de la siembra.

3. siembra en los injertos de células

1. Medir las longitudes de los andamios y si es necesario, cortar a una longitud de 5 mm.
2. Humedezca previamente el andamio con 5 μl de RPMI 5 minutos Retire el RPMI.
3. Añadir 5 μl de la solución de BM-MNC a la luz del andamio durante 10 minutos.
4. Pasar una aguja de 21G a través del lumen del injerto e incubar el injerto en 1000 μl de RPMI durante la noche a 37 ° C en una incubadora.

4. implantación de injerto

Nota: Se debe tener cuidado para mantener la técnica aséptica durante el procedimiento de implantación de injerto.

1. Utilizar ratones C57BL/6 femeninos 6-8 semanas de edad como receptores de los injertos de células sembradas. Inyectar la enrofloxacina (10mg/kg) subcutáneamente 24 h antes de la cirugía y justo antes de la incisión.
2. Peso del ratón y administrar una dosis de 0,1 mL/10 g de Cóctel anestésica de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), ketoprofeno (5 mg/kg) como analgesia por vía intraperitoneal.
3. Compruebe si el plano de la anestesia se ha logrado por el método de cola-pinch. Confirmando el nivel de sedación, aplique un ungüento oftálmico estéril a los ojos y clip de pelo en el sitio quirúrgico desde la barbilla a las clavículas. Coloque el animal en una plataforma en una posición decúbito dorsal. Desinfectar el sitio quirúrgico usando primero una almohadilla de preparación de povidona-yodo seguida de una almohadilla de la preparación del alcohol (alcohol al 70%) y una vez más una almohadilla de preparación del povidone-yodo.
4. Colocar el animal con el microscopio de disección con la cabeza del cirujano. Haga una incisión de línea media que van desde las clavículas hasta el hueso hioides con la ayuda de tijeras finas y pinzas de Adson micro. Limpie la fascia con Dumont #5 y Dumont #7 Pinzas finas, junto con un hisopo de algodón estéril si es necesario y colocar un retractor auto retención de Colibri.
5. Abrir los músculos de la correa (figura 3A) con unas pinzas finas Dumont #5 y #7 Dumont para exponer el cartílago tiroides, cartílago cricoides y la tráquea. Sin rodeos, separar la tráquea de los nervios laríngeos recurrentes, paralela a cada lado, seguido por separación circunferencial de la tráquea del esófago (figura 3B).
6. Utilizando una aguja de 20G y marcador quirúrgico, mancha de la porción anterior de la tráquea.
7. Identificar la tráquea y hacer una incisión por debajo del tercer anillo del cartílago traqueal y transecto la tráquea usando un par de tijeras de Vannas-Tubingen primavera y un par de Pinzas finas Dumont #7. Sujetándola con las pinzas curvas finas, asegure la tráquea distal al esternón mediante estéril sutura de nylon 9-0 para crear una traqueotomía temporal (figura 3C). Nota: Un material de sutura alternativos que puede utilizar es el 9-0 PDS para reapproximation de implantación y el músculo traqueal.
8. Con una aguja de 20G y un marcador quirúrgico, mancha el injerto para representar la porción anterior.
9. Implante del injerto inserción proximal-posterior, lateral proximal y suturas proximal anterior, en ese orden con sutura de nylon estéril de 9-0 (figura 3D), Dumont #7 fina pinzas y un sostenedor de la aguja.
10. Gire el animal 180° para colocar la cola del cirujano. Comunicado de la traqueotomía temporal. Incompleto es transversalmente la tráquea distal para permitir el uso del segmento resecado como un tocón para retracción. Cuando ya no sea necesario, el segmento de tráquea de 5 MM se elimina completamente.
11. Completar la anastomosis distal mediante la colocación de las suturas en la manera similar como la anastomosis proximal.
12. Volver a aproximar la posición del injerto y los músculos de la correa. Cerrar la incisión con suturas de nylon estéril de 9-0 en un patrón de marcha.
13. Inyectar por vía subcutánea 0,1 mL de buprenorfina (0.1 mg/kg) y coloque el animal en una jaula de recuperación a una almohadilla de calefacción sin otros animales en la jaula.
14. Observar el ratón hasta que es consciente y capaz de andar, luego transferir el ratón a una nueva jaula con ropa de cama blanda, húmeda chow y agua medicada (ibuprofeno, 30 mg/kg) durante 48 h. Después de este período de tiempo, volver el ratón en una jaula normal con otros ratones.
    Nota: Ratones que mantienen la dificultad respiratoria o disminución de la actividad después de la implantación son observados por personal de laboratorio o animales en una incubadora de 32 ° C. Si esto continúa por más de 48 h, los ratones deben ser sacrificados.

5. histología e inmunohistoquímica

Nota: Manchas Hematoxylin y la eosina se realizaron mediante técnica estándar por núcleo de morfología de Hospital de los niños en todo el país. Immunohistochemistry fue realizado según los pasos siguientes.

1. Desparafinizar las diapositivas usando 1) xileno para 5 min, 2) xileno durante 5 min, etanol 3) 100% por 5 min, etanol 4) 90% por 5 min, etanol al 5) 70% por 5 min, 6) destilada de H₂O (dH₂O) durante 5 minutos.
2. Sumerja los portaobjetos en solución tampón de citrato y colocar en olla a presión llena de agua. Calentar durante 10 minutos y luego deje que se enfríe a temperatura ambiente. Lavar con seroalbúmina bovina al 0.1% en PBS (BSA-PBS) durante 5 minutos enjuague con dH₂O.
   Nota: Calefacción puede hacerse también con un baño de agua caliente o microondas durante 15 minutos.
3. Incube los portaobjetos con suero de cabra normal del 3% en PBS por 1 h a temperatura ambiente. Lave con 0.1% BSA-PBS por 5 min incubar en anticuerpo primario con concentraciones de queratina 5 (1: 1000)⁶, queratina 14 (1: 250)⁶ y F4/80 (1: 100)⁷ h 18 durante la noche a 4 ° C.
4. Lavar con 0.1% de BSA-PBS dos veces 10 minutos cada lavado. Incubar con el anticuerpo secundario apropiado en concentración de 1: 500 para K5/K14 y 1:300 F4/80 por 1 h a temperatura ambiente. Lavar con 0.1% de BSA-PBS dos veces 10 minutos cada lavado.
5. Montaje con 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) que contiene montaje cubreobjetos de vidrio y medios de comunicación. Dejar para reposar 30 minutos antes de la proyección de imagen.

Resultados

La figura 1 muestra un esquema de TETG siembra e implantación. La médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6 y cultivadas en vitro. BM-multinacionales fueron aisladas por centrifugación de densidad y sembradas en el TETG. TETGs sembrados fueron implantados en un ratón receptor syngeneic de C57BL/6.

Figura 2 es un resumen del andamio TETG PET:PU proceso d...

Discusión

El desarrollo de un modelo de ratón para traquear de ingeniería tisular es esencial en la comprensión de los factores que han limitado la traducción clínica de las TETGs; es decir, colapso del injerto, estenosis y epitelización retardada⁴. Algunos factores que contribuyen a estas limitaciones incluyen la selección del material de injerto, proceso de fabricación, diseño de andamio y célula siembra protocolos. Este modelo permite la más rápida evaluación de estos factores para entender ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20