시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

요약

이식 협 조직 설계 기도 교체에서 중요 한 장애물을 포즈. 협 기본 셀룰러 메커니즘을 조사, 우리 시드 골 단 세포 (BM-MNC)와 조직 설계 tracheal 교체의 murine 모델을 활용 합니다. 여기, 우리가 우리의 프로토콜을 비 계 제조, BM MNC 절연, 이식 시드, 및 주입을 포함 하 여 선발.

초록

선 천 성 또는 보조 긴 세그먼트 tracheal 결함에 대 한 치료 옵션 역사적으로 기능 조직을 대체 하는 무 능력으로 인해 제한 되었습니다. 조직 공학 3 차원 비 계에 세포 신호 분자를 통합 하는 기능과 잠재적인 솔루션으로 위대한 약속을 보유 하고있다. 조직 설계 tracheal 이식 (TETGs)와 최근 작품 본 일부 성공 하지만 그들의 번역 이식 협 착에 의해 제한 되어, 붕괴, 이식 epithelialization 지연. 이러한 문제를 운전 하는 메커니즘을 조사 하기 위하여 우리는 조직 설계 tracheal 이식 이식에 대 한 마우스 모델을 개발 했습니다. TETGs 애완 동물 및 PU (과 % 무게)의 혼합물에 electrospun 고분자 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)과 폴리우레탄 (PU)를 사용 하 여 건설 되었다. 건설 기계 했다 다음 골 단 세포 6-8 주에서 격리를 사용 하 여 시드-그라데이션 원심 분리에 의해 오래 된 C57BL/6 쥐. 이식 당 10 백만 셀 발판의 루멘에 시드 되었고 제 3의 그리고 일곱 번째 tracheal 반지 사이 주입 전에 밤새 품 어 수 있습니다. 이러한 이식 협 착 증의 결과 정리 할 수 있었고, 조직학 분석과 면역 형광 검사에서 기저 상피 세포 각 질 5와 각 질 14의 부족에 의해 증명으로 epithelialization를 지연. 이 모델은 개장 하는 호스트에 관련 된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 하기 위한 도구로 될 것입니다.

서문

긴 세그먼트 tracheal 결함 완전 tracheal 반지 및 tracheal agenesis로 외상, 악성 종양, 감염 등 희귀 한 선 천 적 조건으로 제시할 수 있습니다. 성인 또는 어린이 tracheal 길이의 30%에서 6 cm를 초과 하는 경우 이러한 결함 수술 재건에 의해 대우 될 수 없습니다. 자가 조직, 싱가포르로 이주, 및 인공 구조와 기도 대체 하려고 만성 감염, 알갱이 만듦, 기계 고장, 그리고 협 착 증에 의해 괴 롭 혀 되었습니다.

조직 설계 tracheal 이식 (TETGs) 잠재적으로 평생 면역 억제에 대 한 필요성을 피하고 있는 동안이 문제를 해결할 수 있습니다. 지난 10 년간에서 TETGs 동물 모델에서 테스트 고 동정 사용^1,2,3의 드문 경우에 임상적으로 활용 되었습니다. 임상 및 큰 동물 연구에서 조직 설계 기도 교체에서 수술 복구 필요한 전투 협 수많은 개입 (정의 > 50 %luminal 좁히기) 고 기도 patency 유지. 추가 TETG 작업을 선택, vascularization와 비 계 디자인 시드 셀의 역할 평가 통해이 협 착이 증을 줄이기 위해 노력해왔다. 셀 시드 선택 및 비 계 디자인 네이티브 기관지 구조/기능을 복원 하기 위한 주로 호흡 상피 세포 및 다양 한 resorbable, 비-resorbable 및 decellularized 건설 기계에 시드 chondrocytes에 집중 되었습니다. 로 vascularization 가능성이 협의 개발에 중요 한 역할을, 다른 그룹 생체 외에서 또는 heterotopic 모델 revascularization 또는 neoangiogenesis⁴를 신속 하 게 최적화에 집중 했다. 그럼에도 불구 하 고, 또한 기계적으로 유능 하 고 기능 TETG를 유지 하면서 성공적인 vascularization 달성 도전 남아 있습니다. 최근 발전에도 불구 하 고 협 최소화 임상 번역 중요 한 장애물을 남아 있다.

이 histopathological 응답 TETG 주입에서 vivo에서조사, 우리 조직 설계 tracheal 교체의 양 모델을 개발 했다. 이식 혼합된 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)과 폴리우레탄 (PU) electrospun 비 계 골 파생 된 단 세포 (BM-MNCs) 시드 구성 되었다. 이 작은 일대에 우리 시드 헌 BM MNCs 다시 epithelialization 가속 및 지연 협⁵시연. 비록 헌 BM MNCs 향상 생존 시드는 BM MNCs 조절 기능 neotissue의 형성 세포 메커니즘 불분명 남아 있습니다.

조직의 murine 모델의 세포질 수준 필요한 개발 조사 설계 tracheal 교체. 양 연구와 마찬가지로, 우리는 BM로 시드 PET:PU electrospun 비 계 활용-MNCs. 일관성 양 모델, TETG 협 이식^{1,2,3 다음 첫 2 주에 걸쳐 개발 ,5}. 이 murine 모델을 더 기도 협 착을 기본 셀룰러 메커니즘을 심문 이전에 관찰 병 리 지 제안 했다.

이 보고서에서 우리 조직 설계 tracheal 교체 비 계 제조, BM MNC 절연, 시드, 이식 및 이식 (그림 1, 그림 2)를 포함 하 여 마우스 모델에 대 한 우리의 프로토콜 세부.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 전국 어린이 병원에 의해 승인 되었습니다.

1. 비 계 제조

1. 하 여 폴리머 nanofiber 전조 솔루션 준비: 1) 녹이는 8 wt % 애완 동물 2) 실 온에서 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol에서 3 wt %PU 용 해 하 여 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol 및 60 ° C에 솔루션을가 열.
2. 일단 냉각, 애완 동물 및 PU (과)의 최종 폴리머 혼합물을 만드는 솔루션을 결합 합니다.
3. 스테인레스 스틸 로드 (1 밀리미터 직경)에 PET+ PU 솔루션 PET:PU 솔루션으로 가득 60 mL 주사기에 20 G 무딘 팁 바늘을 이용 하 여 높은 전압 DC 전원 공급 장치 설정 14 사용 하 여 바늘, 다른 높은 전압 DC 전원에 kV 공급-3로 설정 하는 Electrospin kV 5 mL/h 흐름 속도 20 cm 팁-기판 거리. 섬유 증 착 동안 350 rpm에서 막대를 회전 합니다.
4. 300 µ m의 원하는 비 계 벽 두께 얻을 때까지 전기를 계속 합니다. 비 계는 막대에서 슬라이드 다음 하룻밤 어떤 잔여 용 매를 제거 하려면 진공에서 개최.
5. 이식 전에 350 mJ/cm² 의 자외선 빛 복용량을 사용 하 여 발판 소독.

2. 골 수 파생 된 단 세포 (BM-MNC) 수확

1. 안락사는 6-8 주 오래 된, 여성, C57BL/6 마우스 마 취 제 (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg)과 ketoprofen (10 mg/kg)의 칵테일. 꼬리 핀치 방법으로 완전 한 안락사에 대 한 확인 합니다. 안락사에 대 한 지역의 지침을 따르도록 해야 합니다.
2. 무 균 조건 하에서 화관과 tibias 좋은 위 및 마이크로 Adson 집게를 사용 하 여 뼈를 노출 하는 피부를 제거 합니다. Dumont #5 집게 및 Dumont #5/45 집게를 사용 하 여 근 막 및 힘 줄을 제거 하. 뼈를 분리 하 고 양쪽에 그들의 각각을 잘라. 5 mL 주사기와 25 G 바늘 using Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 미디어의 30 mL를 포함 하는 페 트리 접시에 골 수 플러시. 50 mL 튜브에 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 골 수와이 RPMI를 필터링 합니다.
3. Biosafety 내각에 15 mL 튜브에 polysurcrose와 나트륨 diatrizoate의 5 mL을 놓습니다. 2 개의 층의 혼합을 방지 하려면 RPMI 튜브의 측면 골 단 세포를 포함 하는 부드럽게 추가 합니다. 원심 분리기와 30 분 461 x g 에 "브레이크 1" 24 ° c.에
   참고: 우리의 원심 분리기에 브레이크 1 약자는 긴 시간 감속 동안에 밖으로 실행합니다.
4. 형성 하는 3 개의 층에서 플라즈마의 탑 (핑크) 레이어를 삭제 하 고 골 단 세포로 구성 된 중간 (명확한) 레이어를 수집 합니다. 적혈구의 침전을 삭제 합니다.
5. 24 ° c.에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) "브레이크 9" 1:1 비율에 461 x g 에서 원심 분리기로 10 분에 골 단 세포 (BM-MNC)를 희석
6. 상쾌한을 제거 하 고 PBS의 5 mL와 펠 릿을 희석. 원심 분리기로 10 분 동안 461 x g 에 "브레이크 9" 24 ° c.에
7. 제거는 상쾌한 고 RPMI의 ~ 10 mL와 펠 릿을 희석.
8. 0.4 %trypan 파랑 1 mL 튜브에의 동등한 양으로 BM MNC 솔루션의 10 µ L를 희석. 챔버 슬라이드를 계산 하는 셀에 솔루션의 장소 10 µ L. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 단계를 반복 하 고 셀의 평균 수를 계산 합니다.
   참고: 1 X 10⁸ 셀의 평균 세포 수 두 기증자 마우스의 사용에서 얻은 했다. 이 두 개의 화관에 해당 될 것 이며 골 수 뼈 두 tibias 격리.
9. 24 ° c.에서 10 분 동안 461 x g 에서 BM MNC 솔루션 "브레이크 9" 원심 상쾌한을 제거 하 고 10⁷ 셀/이식에 셀 농도 희석.
   참고: 우리 공부 1, 10 및 100 백만 셀 사이의 효율 시드 하 고 이식 당 10 백만 셀 높은 시드 효율 산출 발견.

3입니다. 세포는 이식에 시드

1. 장비의 길이 측정 하 고, 필요한 경우 5 m m의 길이에 그들을 잘라.
2. 미리 젖은 5 분 제거는 RPMI 위한 RPMI의 5 µ L로 비 계.
3. 10 분 동안 발판의 루멘에 BM MNC 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다.
4. 이식의 루멘을 통해 21 G 바늘을 통과 하 고 품 어 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 RPMI의 1000 µ L에 이식.

4. 이식 이식

참고: 관리는 이식 이식 절차 동안 무 균 기법을 유지 하기 위해 취해야 한다.

1. 받는 사람으로 6 8 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 셀 시드 이식에 대 한. Enrofloxacin (10 mg/kg) 피하 주사의 바로 전에 절 개 수술 전과 24 h.
2. 그리고 마우스 무게 intraperitoneally 진통으로 케 타 민 (100mg/kg), xylazine (10 mg/kg)과 ketoprofen (5 mg/kg)의 마 취 칵테일의 0.1 mL/10 g 복용량을 관리.
3. 마 취의 비행기 꼬리 핀치 방법에 의해 달성 되었습니다 경우 확인 하십시오. 진정의 수준을 확인, 눈에 불 임 안과 연 고를 적용 하 고 clavicles에서 턱 수술 사이트에 머리를 클립. 장소 등 휴식 위치에서 패드에 동물. Povidone-요오드 준비 패드, 뒤에 알코올 준비 패드 (70% 알코올), 그리고 한 번 더 povidone-요오드 준비 패드 먼저 사용 하 여 수술 부위의 소독.
4. 외과 의사에서 머리와 해 현미경 동물을 놓습니다. 좋은 위 및 마이크로 Adson 겸의 도움으로 hyoid 뼈는 clavicles에서 배열 하는 중간 절 개를 확인 합니다. Dumont # 5와 필요, 하 고 자기 유지 Colibri 견인 삽입 경우 멸 균 면봉 함께 Dumont #7 좋은 집게 근 막 청소.
5. 갑 상선 연골, 반지 연골과 기도 노출 하 몬 트 #5 및 Dumont #7 좋은 집게와 스트랩 근육 (그림 3A)를 엽니다. 퉁 명 스럽게 회귀 후 두 신경 식도 (그림 3B)에서 기도의 원주 분리 뒤 양쪽에 병렬 실행에서 기도 구분 합니다.
6. Using 20 G 바늘과 수술 표식, 기관지의 앞쪽 부분 얼룩.
7. 기도 식별 하 고 세 번째 tracheal 연골 반지 아래 절 개 transect 욕실이 Tubingen 봄이 위 및 Dumont #7 좋은 집게의 쌍을 사용 하 여 기관. 고급 곡선된 겸 자와 그것을 잡고, 살 균을 사용 하 여 흉 골을 말 초 기관지를 만드는 임시 tracheostomy (그림 3C) 9-0 나일론 봉합 보안. 참고: 사용할 수 있는 대체 봉합 사 물자 tracheal 주입 및 근육 reapproximation에 대 한 9-0 PDS는.
8. 20 G 바늘과 수술 표식, 앞쪽 부분을 표현 하기 위해 이식 얼룩.
9. 근 위-후부, 인접 측면 삽입 이식 임 플 란 트 하 고 9-0 살 균 나일론 봉합 (그림 3D), 몬 트 # 7을 사용 하 여 순서 대로 인접 앞쪽 봉합 좋은 집게와 바늘 홀더.
10. 외과에서 꼬리를 동물 180 °를 설정 합니다. 임시 tracheostomy를 놓습니다. 말 초 기관 철회에 대 한 그 루터 기로 절제 세그먼트의 사용을 허용 하도록 transected 불완전 이다. 더 이상 필요 하지, 5 MM 기관 세그먼트 완전히 제거 됩니다.
11. 근 위 문 합으로 비슷한 패션에는 봉합을 배치 하 여 원심 문 합을 완료 합니다.
12. 다시 이식 위치와 스트랩 근육 대략적인. 운영 하는 본에 9-0 살 균 나일론 봉합을 사용 하 여 절 개를 닫습니다.
13. Buprenorphine (0.1 mg/kg)의 0.1 mL를 피하 주사 하 고 다른 동물 케이지에서 없이 난방 패드에 복구에에서 동물을 배치.
14. 의식 하 고 ambulate, 다음 부드러운 침구, 촉촉한 차 우와 48 h에 대 한 치료 물 (이 부 프로펜, 30 mg/kg)로 새로운 케이지를 마우스를 전송할 수 있게 될 때까지 마우스를 관찰 합니다. 이 기간 후 마우스를 다른 마우스와 일반 케이지 돌아갑니다.
    참고: 마우스는 호흡 곤란을 유지 또는 이식 후 활동 감소는 32 ° C 배양 기에서 실험실 및 동물 또는 직원에 의해 관찰 된다. 이 48 시간 이상 계속 되 면 쥐 안락사 해야 한다.

5. 조직학 및 Immunohistochemistry

참고: Hematoxylin에 오신 얼룩 했다 표준 기술을 사용 하 여 의해 수행 전국 어린이 병원 형태학 코어. Immunohistochemistry에 따라 수행 된 단계 아래.

1. 슬라이드 deparaffinize H₂O (dH₂O) 5 분 5 분, 5 분 동안 2) 크 실 렌, 5 분, 5 분의 4) 90% 에탄올, 5 분, 5) 70% 에탄올 3) 100% 에탄올에 대 한 1) 크 실 렌을 사용 하 여 6) 증류수.
2. 시트르산 버퍼에 슬라이드를 잠수함과 물 가득 압력 밥 솥에 놓습니다. 다음 10 분 동안 열 실내 온도에 냉각 수 있습니다. 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA-PBS) PBS에와 dH₂오 분 린스 세척
   참고: 난방도 온수 욕조 또는 15 분 동안 전자 레인지로 할 수 있습니다.
3. 3% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 슬라이드를 품 어. 0.1%와 세척 5 (1:1000)⁶각 질 14 (1: 250)⁶ , 4 ° c.에 하룻밤 18 h f 4/80 (1: 100)⁷ BSA-PBS 5 분에 대 한 각 질에 대 한 농도와 1 차 항 체에 품 어
4. 0.1% BSA PBS 두 번 10 분 동안 각 세척 세척. K5/K14 및 1:300 F4/80 실 온에서 1 h 1: 500의 농도에서 적절 한 2 차 항 체로 품 어. 0.1% BSA PBS 두 번 10 분 동안 각 세척 세척.
5. 마운트 4', 6-diamidino-2-phenolindole를 사용 하 여 (DAPI) 포함 하는 설치 미디어와 유리 커버 전표. 이미징 하기 전에 30 분 동안 앉아서 수 있습니다.

결과

그림 1 에서는 TETG 시드 및 이식의 회로도를 보여 줍니다. 골 수는 C57BL/6 마우스에서 수확 했다 하 고 체 외에서배양. BM MNCs 밀도 원심 분리에 의해 분리 되었고에 TETG에 시드. 시드 TETGs syngeneic 받는 사람 C57BL/6 마우스에 이식 했다.

그림 2 는 PET:PU TETG 비 계 제조 공정에 대 한 개...

토론

조직 설계 tracheas에 대 한 마우스 모델의 개발 요인 임상 번역 TETGs;의 제한 된 이해에 필수적 이다 즉 이식 붕괴, 협 착 증 및 지연된 epithelialization⁴. 이러한 제한에 기여 하는 몇 가지 요인이 이식 재료, 제조 공정, 비 계 디자인 및 프로토콜 시드 셀의 선택을 포함 합니다. 이 모델 빠른 평가 이러한 요인의 영향을 미치는 세포 및 분자 메커니즘을 이해 하기 위해 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20