Ensemencement et Implantation d’un greffon biosynthétique de trachéale tissulaire dans un modèle murin

Résumé

Sténose de la greffe constitue un obstacle critique en remplacement de tissu conçu des voies respiratoires. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous‑tendent la sténose, nous utilisons un modèle murin de remplacement trachéale tissu machiné avec ensemencé la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-MNC). Ici, nous détaillons notre protocole, y compris la fabrication d’échafaudages, BM-MNC isolement, semis de la greffe et l’implantation.

Résumé

Options de traitement pour les défauts trachéale segment long congénitale ou secondaire ont historiquement été limitées en raison de l’incapacité de remplacer des tissus fonctionnels. Génie tissulaire est très prometteur comme une solution possible, grâce à sa capacité à intégrer les cellules et molécules de signalisation dans un échafaudage en 3 dimensions. Des travaux récents avec tissu machiné trachéale greffes (TETGs) a connu quelques succès, mais leur traduction a été limitée par une sténose greffon, effondrement de greffe et retardé l’épithélialisation. Afin d’étudier les mécanismes conduisant à ces questions, nous avons développé un modèle murin pour l’implantation de prothèse trachéale tissu machiné. TETGs ont été construits à l’aide d’électrofilées polymères en polyéthylène téréphtalate (PET) et polyuréthane (PU) dans un mélange d’animal de compagnie et d’unité centrale (20 80 pour cent de poids). Les échafaudages ont été ensemencées puis à l’aide de la moelle osseuse des cellules mononucléaires isolés de 6 à 8 semaines-vieilles souris C57BL/6 par centrifugation en gradient. 10 millions de cellules par greffon ont été ensemencées dans le lumen de l’échafaudage et incubés pendant la nuit avant l’implantation entre les troisième et septième trachées anneaux. Ces greffes ont réussi à récapituler les résultats de la sténose et retardé l’épithélialisation tel que démontré par l’analyse histologique et le manque de kératine 5 et 14 de la kératine les cellules épithéliales basales sur immunofluorescence. Ce modèle servira comme outil pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’hôte de remodelage.

Introduction

Long segment trachéales congénitales peuvent présenter comme des affections congénitales rares tels que les anneaux trachéaux complets et l’agénésie trachéale, ainsi qu’un traumatisme, malignité et l’infection. Cas de dépassement de 6 cm en adultes, soit 30 % de la longueur trachéale chez les enfants, ces défauts ne peuvent être traités par reconstruction chirurgicale. Tentatives de remplacer les voies respiratoires par tissus autologues, greffes cadavériques et des constructions artificielles ont été en proie à une infection chronique, granulation, défaillance mécanique et une sténose.

Tissu machiné trachéales greffes (TETGs) peuvent potentiellement résoudre ces problèmes tout en évitant la nécessité d’une immunosuppression toute la vie. Au cours de la dernière décennie, TETGs ont été testées dans des modèles animaux et utilisés cliniquement dans de rares cas d’un usage compassionnel^1,2,3. Dans les cliniques et les grandes études animales, convalescence postopératoire de tissu conçu des voies aériennes remplacement requis nombreuses interventions pour sténose combattre (définie comme > 50 % de rétrécissement Luminale) et maintenir la perméabilité des voies aériennes. Des travaux supplémentaires de TETG a cherché à réduire cette sténose par le biais de l’évaluation du rôle de cellule ensemencement de choix, de vascularisation et de design de l’échafaudage. Cellule semis choix et conception d’échafaudage visant à restaurer la trachée native structure/fonction ont principalement portés sur les cellules épithéliales respiratoires et chondrocytes ensemencés sur des échafaudages résorbables, non résorbables et decellularise diverses. Comme susceptibles de vascularisation joue un rôle majeur dans le développement de la sténose, autres groupes ont mis l’accent sur l’optimisation in vitro ou modèles hétérotopiques pour accélérer la revascularisation ou néoangiogénèse⁴. Réalisation de vascularisation avec succès tout en conservant un TETG mécaniquement compétent et fonctionnel reste néanmoins un défi. Malgré des progrès récents, minimisant la sténose demeure un obstacle critique traduction clinique.

Pour étudier cette réponse histopathologique à TETG implantation in vivo, nous développé un modèle ovin de tissu conçu remplacement trachéale. La prothèse était composée d’un mélange de polyéthylène téréphtalate (PET) et polyuréthane échafaudage d’électrofilées (PU), ensemencé avec la moelle osseuse des cellules mononucléaires (BM-PTM). Dans cette petite cohorte, nous avons démontré qu’ensemencés autologue BM-PTM accéléré réépithélialisation et retardé la sténose⁵. Bien que l’ensemencement avec autologue BM-PTM amélioré la survie, le mécanisme cellulaire par lequel BM-PTM module la formation de neotissue fonctionnelle ne sait pas.

Enquête sur le développement nécessaire niveau cellulaire d’un modèle murin de tissu conçu remplacement trachéale. Semblable à l’étude de l’espèce ovine, nous avons utilisé un échafaudage d’électrofilées PET:PU ensemencé avec BM-PTM. en accord avec le modèle ovin, sténose TETG développé au cours des deux premières semaines suivant l’implantation^{1,2,3 ,},⁵. Cela suggère que le modèle murin récapitulé la pathologie observée plus tôt, ce qui nous permet d’interroger davantage les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la sténose des voies respiratoires.

Dans ce rapport, nous détaillons notre protocole pour tissulaire génétiquement modifié, remplacement trachéale chez la souris y compris fabrication d’échafaudage, isolation BM-MNC, greffon ensemencement et l’implantation (Figure 1, Figure 2).

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’hôpital de l’enfant dans tout le pays.

1. fabrication d’échafaudage

1. Préparer une solution de précurseur de nanofibres de polymère par : 1) dissolution 8 % en poids de PET en 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol et la solution à 60 ° C et de chauffage par 2) dissolution de 3 % en poids d’unité centrale en 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol à température ambiante.
2. Une fois refroidi, mélanger les solutions pour créer un mélange polymère final de PET et PU (20-80).
3. Electrospin la solution PET+ PU sur une tige en acier inoxydable (diamètre de 1 mm) en utilisant une aiguille pointe émoussée de 20 G sur une seringue de 60 mL, remplie de la solution de PET:PU à l’aide d’un ensemble d’alimentation haute tension DC alimentation à + 14 kV sur l’aiguille, une autre haute tension DC fournir ensemble à -3 kV , un débit de 5 mL/h et une distance de pointe-à-substrat de 20 cm. Faire pivoter la tige à 350 tr/min pendant la déposition de la fibre.
4. Continuer électrofilage jusqu'à obtenue l’épaisseur désirée échafaudage de 300 µm. Glissez l’échafaud au large de la tige, puis maintenez-le sous vide pendant la nuit pour éliminer n’importe quel solvant résiduel.
5. Stériliser à l’échafaud en utilisant une dose de lumière ultraviolette de 350 mJ/cm² avant l’implantation.

2. dérivés de la moelle osseuse des cellules mononucléées (BM-MNC) récolte

1. Euthanasier un 6-8 semaines vieux, femme, C57BL/6 souris avec un cocktail de kétamine (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg) et le kétoprofène (10 mg/kg). Vérifiez l’euthanasie complet en méthode queue-pincée. N’oubliez pas de suivre les directives locales d’euthanasie.
2. Dans des conditions stériles, enlever la peau sur les fémurs et tibias pour exposer l’os à l’aide des ciseaux et pinces micro-Adson. Utilisez Dumont #5 pinces et pinces Dumont #5/45 pour enlever le fascia et les tendons. Séparez les os et coupez chacun d’eux sur les deux extrémités. À l’aide d’une seringue de 5 mL et une aiguille 25G, rincer la moelle osseuse dans une boîte de pétri contenant 30 mL de médias Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Filtrer cette RPMI avec la moelle osseuse à travers un tamis de cellule 70 µm en nylon dans un tube de 50 mL.
3. Dans une armoire de sécurité biologique, placer 5 mL de diatrizoate de polysurcrose et de sodium dans un tube de 15 mL. Doucement ajouter le RPMI contenant des cellules mononucléaires de moelle osseuse sur le côté du tube pour éviter le mélange des deux couches. Centrifugeuse à 461 x g pendant 30 min avec « frein 1 », à 24 ° C.
   Remarque : Sur notre centrifugeuse, frein 1 correspond à la plus longue s’épuiser pendant la décélération.
4. Sur les trois couches formées, jetez la couche supérieure (rose) de plasma et recueillir la couche intermédiaire (claire), comprenant les cellules mononucléaires de la moelle osseuse. Jeter le précipité des globules rouges.
5. Diluer les cellules mononucléaires de la moelle osseuse (BM-MNC) en tampon phosphate salin (PBS) dans un rapport 1:1 et centrifuger à 461 x g pendant 10 min avec « frein 9 » à 24 ° C.
6. Retirez le surnageant et diluer le culot avec 5 mL de PBS. Centrifugeuse à 461 x g pendant 10 min avec « frein 9 » à 24 ° C.
7. Retirez le surnageant et diluer le culot avec environ 10 mL de milieu RPMI.
8. Diluer 10 µL de la solution de BM-MNC avec un volume égal de 0,4 % trypan bleu dans un tube de 1 mL. Déposer 10 µL de la solution dans une cellule de comptage des diapositives de la chambre. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Répétez l’étape et calculer le nombre moyen de cellules.
   Remarque : Un nombre moyen de cellules de 1 X 10⁸ cellules provenaient de l’utilisation de deux souris de donateurs. Cela équivaudrait à deux fémurs et deux tibias qui OS à moelle est isolé.
9. Centrifuger la solution BM-MNC à 461 x g pendant 10 min avec « Frein 9 » à 24 ° C. Retirez le surnageant et diluer la concentration en cellules à 10⁷ cellules/greffon.
   NOTE : Nous avons étudié l’ensemencement efficacité entre 1, 10 et 100 millions de cellules et trouvé que 10 millions de cellules par greffon fournit la plus grande efficacité de semis.

3. cellule ensemencement sur les greffes

1. Mesurer les longueurs des échafaudages et le cas échéant, les couper à une longueur de 5 mm.
2. Pré humide l’échafaud 5 µl de RPMI pendant 5 min. retirer le RPMI.
3. Ajouter 5 µL de la solution de BM-MNC à la lumière de l’échafaudage pendant 10 min.
4. Passez une aiguille 21G, grâce à la lumière de la prothèse et incuber le greffon pour 1000 µL de RPMI pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur.

4. Implantation de greffe

Remarque : Il faut maintenir une technique aseptique pendant la procédure d’implantation de prothèse.

1. Utiliser les souris C57BL/6 femelles âgées de 6-8 semaines comme bénéficiaires pour les greffes de cellules ensemencées. Injecter l’enrofloxacine (10mg/kg) par voie sous-cutanée 24h avant la chirurgie et juste avant l’incision.
2. Peser la souris et administrer une dose de 0,1 mL/10 g du cocktail anesthésique kétamine (100 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) et le kétoprofène (5 mg/kg) comme l’analgésie par voie intrapéritonéale.
3. Vérifier si le plan de l’anesthésie a été réalisé par la méthode queue-pincement. Confirmant le niveau de sédation, appliquer un onguent ophtalmique stérile pour les yeux et couper les cheveux sur le site de la chirurgie du menton aux clavicules. Placez l’animal sur un coussin en position couchée dorsale. Désinfecter le site chirurgical en utilisant d’abord un tampon alcoolisé povidone-iode, suivie d’un tampon alcoolisé (alcool à 70 %) et une fois de plus un tampon alcoolisé povidone-iode.
4. Placez l’animal sous le microscope à dissection avec sa tête loin du chirurgien. Faire une incision médiane allant de clavicules à l’os hyoïde, avec l’aide des ciseaux et pinces micro-Adson. Nettoyer le carénage avec Dumont #5 et Dumont #7 des pinces fines, avec un tampon de coton stérile, si nécessaire, insérez un rétracteur de Colibri autoblocants.
5. Ouvrez les muscles de la sangle (Figure 3A) avec une pince fine Dumont #5 et #7 de Dumont pour exposer le cartilage thyroïde, le cartilage cricoïde et la trachée. Carrément la trachée séparer les nerfs laryngés récurrents en parallèle de chaque côté, suivie d’une séparation circonférentielle de la trachée de le œsophage (Figure 3B).
6. À l’aide d’une aiguille de 20G et marqueur chirurgical, détachant la partie antérieure de la trachée.
7. Identifier la trachée et faites une incision sous le troisième anneau trachéal cartilage et la trachée, à l’aide d’une paire de ciseaux de Vannas-Tubingen printemps et une paire de pinces fines Dumont #7 du transect. Tenant à la fine pince courbée, garantir la trachée distale au sternum en utilisant stérile suture nylon 9-0 pour créer une trachéostomie temporaire (Figure 3C). Remarque : Un matériel de suture alternative qui peut être utilisé est le PDS de 9-0 pour les rerapprochement de l’implantation et le muscle trachéal.
8. Avec une aiguille de 20G et un marqueur chirurgical, tacher le greffon pour représenter la partie antérieure.
9. Implanter la prothèse insertion proximale-postérieur, proximaux bilatéraux et des points de suture proximale-antérieure, dans cet ordre à l’aide de sutures stériles en nylon de 9-0 (Figure 3D), Dumont #7 fines pinces et un porte-aiguille.
10. Tourner les animaux 180° pour placer sa queue loin du chirurgien. Communiqué de la trachéotomie temporaire. La trachée distale est incomplètement recoupée afin de permettre l’utilisation du segment réséqué comme une souche de rétraction. Quand n’est plus nécessaire, le segment de trachée de 5 MM est supprimé complètement.
11. Terminez l’anastomose distale en plaçant les sutures de la même façon comme l’anastomose proximale.
12. Re-approximativement la position de la prothèse et les muscles de la sangle. Refermer l’incision à l’aide de sutures stériles en nylon 9-0 dans un modèle en cours d’exécution.
13. Injecter par voie sous-cutanée de 0,1 mL de la buprénorphine (0,1 mg/kg) et placer l’animal dans une cage de récupération placée sur un coussin chauffant sans autres animaux dans la cage.
14. Observer la souris jusqu'à ce qu’il est conscient et capable de marcher, puis transférer la souris à une nouvelle cage avec literie molle, chow humide et l’eau médicamentée (ibuprofène, 30 mg/kg) pendant 48 h. Après ce laps de temps, retourner la souris à une cage normale avec les autres souris.
    NOTE : La souris qui maintiennent une détresse respiratoire ou diminution de l’activité après l’implantation sont observées par le personnel de laboratoire ou animales dans un incubateur à 32 ° C. Si le problème persiste pendant plus de 48 h, puis les souris devraient être euthanasiés.

5. histologie et l’immunohistochimie

NOTE : Hématoxyline et éosine taches effectuées utilisant la technique standard de Nationwide Children Hospital morphologie Core. L’immunohistochimie a été réalisée conformément à la procédure ci-dessous.

1. Déparaffiner les diapositives à l’aide de xylène 1) pour 5 min, xylène 2) pendant 5 min, 3) 100 % éthanol pendant 5 min, 4) 90 % éthanol pendant 5 min, 5) 70 % éthanol pendant 5 min, 6) distillée H₂O (dH₂O) pendant 5 min.
2. Plonger les diapositives de tampon citrate et placer dans l’autocuiseur rempli d’eau. Chauffer pendant 10 min puis laisser refroidir à température ambiante. Laver avec 0,1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS (BSA-PBS) pendant 5 min. rincer avec dH₂O.
   Remarque : Chauffage peut aussi être fait avec un bain d’eau chaude ou le micro-ondes pendant 15 min.
3. Incuber les lames avec 3 % de sérum de chèvre normal en PBS pendant 1 h à température ambiante. Laver avec 0,1 % BSA-PBS pendant 5 min. incuber en anticorps primaire avec des concentrations de kératine 5 (1 : 1000)⁶, la kératine 14 (1/250)⁶ et F4/80 (1/100) de⁷ à 18 h pendant la nuit à 4 ° C.
4. Laver avec 0,1 % BSA-PBS deux fois pendant 10 min chacun se laver. Incubation avec l’anticorps secondaire approprié à la concentration de 1/500 pour K5/K14 et 1 : 300 F4/80 pendant 1 h à température ambiante. Laver avec 0,1 % BSA-PBS deux fois pendant 10 min chacun se laver.
5. Montage à l’aide de 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) contenant le support média et verre de lamelles. Laisser pour reposer pendant 30 min avant l’imagerie.

Résultats

La figure 1 illustre un schéma du TETG ensemencement et implantation. La moelle osseuse a été récoltée de souris C57BL/6 et cultivés in vitro. BM-multinationales ont été isolés par centrifugation de densité et ensemencés sur le TETG. TETGs graines ont été implantés en souris destinataire syngénique C57BL/6.

La figure 2 est une vue d’ensemble de...

Discussion

Développement d’un modèle de souris de trachées de tissu conçu est essentiel dans la compréhension des facteurs qui ont limité la traduction clinique des TETGs ; nommément greffe s’effondrer, sténose et retardé l’épithélialisation⁴. Quelques-uns des facteurs qui contribuent à ces limitations incluent la sélection du greffon, le procédé de fabrication, conception d’échafaudage et cellule ensemencement des protocoles. Ce modèle permet une évaluation plus rapide de ces fact...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20