Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino

Riepilogo

Stenosi dell'innesto per rappresentare un ostacolo critico in sostituzione di tessuto ingegnerizzato delle vie respiratorie. Per studiare i meccanismi cellulari alla base di stenosi, utilizziamo un modello murino di tessuti ingegnerizzati sostituzione tracheale con cellule mononucleari seminato del midollo osseo (BM-MNC). Qui, abbiamo dettaglio nostro protocollo, compreso produzione dell'impalcatura, BM-MNC isolamento, innesto semina e l'impianto.

Abstract

Opzioni di trattamento per difetti tracheale congenita o secondaria lungo segmento storicamente sono state limitate a causa di un'incapacità di sostituire il tessuto funzionale. Ingegneria tissutale tiene la grande promessa come potenziale soluzione con la sua capacità di integrare le cellule e molecole di segnalazione di un'impalcatura 3-dimensionale. Lavoro recente con innesti di tessuto ingegnerizzato tracheale (TETGs) ha visto un certo successo, ma loro traduzione è stata limitata dalla stenosi dell'innesto, innesto crollo e ritardato epithelialization. Al fine di indagare i meccanismi che guidano questi problemi, abbiamo sviluppato un modello murino per l'impianto di protesi tracheale ingegnerizzata. TETGs sono stati costruiti utilizzando elettrofilate polimeri in polietilene tereftalato (PET) e poliuretano (PU) in una miscela di PET e PU (20: 80 per cento del peso). Ponteggi sono state seminate utilizzando cellule mononucleari del midollo osseo isolate da 6-8 settimana-vecchi topi C57BL/6 tramite centrifugazione di pendenza. 10 milioni di cellule per innesto sono state seminate sul lume dell'impalcatura e lasciate Incubare durante la notte prima dell'impianto tra i terzi e settimo tracheali anelli. Questi innesti sono stati in grado di riassumere i risultati di stenosi e ritardato epithelialization come dimostrato dall'analisi istologica e la mancanza di cheratina 5 e la cheratina 14 cellule epiteliali basali su immunofluorescenza. Questo modello servirà come uno strumento per indagare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nel rimodellamento di host.

Introduzione

Lungo-segmento tracheali difetti possono presentare come congenite rare condizioni come completi anelli tracheali e agenesia della trachea, così come traumi, malignità e infezione. Quando superiore a 6 cm in 30% della lunghezza trachea in bambini o adulti, questi difetti non possono essere trattati con ricostruzione chirurgica. Tentativo di sostituire le vie respiratorie con tessuto autologo, trapianto cadaverico e costrutti artificiali è stati afflitti da infezione cronica, granulazione, guasto meccanico e stenosi.

Innesti di tessuto ingegnerizzato tracheali (TETGs) possono potenzialmente risolvere questi problemi, evitando la necessità di immunosoppressione tutta la vita. Nell'ultimo decennio, TETGs sono stati testati in modelli animali e utilizzate clinicamente in rari casi di uso compassionevole^1,2,3. Negli studi sugli animali sia clinici che grandi, recupero post-operatorio da tessutale delle vie respiratorie sostituzione necessari numerosi interventi per stenosi combattimento (definita come > 50% lo stringimento luminal) e mantenere la pervietà delle vie aeree. Lavoro supplementare TETG ha cercato di ridurre questa stenosi attraverso valutare il ruolo della semina scelta, vascolarizzazione e impalcatura design cellulare. Impalcatura design finalizzate al ripristino nativo trachea struttura/funzione e scelte semina delle cellule sono stati concentrati principalmente su cellule epiteliali respiratorie e condrociti seminati su vari ponteggi riassorbibili, non riassorbibile e decellularizzati. Come vascolarizzazione probabilmente gioca un ruolo importante nello sviluppo di stenosi, altri gruppi hanno messo a fuoco sull'ottimizzazione in vitro o eterotopica modelli per accelerare la rivascolarizzazione o neoangiogenesi⁴. Ciò nonostante, ottenendo successo vascolarizzazione pur mantenendo un TETG meccanicamente competenti e funzionale rimane una sfida. Nonostante i recenti progressi, riducendo al minimo la stenosi rimane un ostacolo fondamentale alla traduzione clinica.

Per studiare questa risposta istopatologica a TETG l'impianto in vivo, abbiamo sviluppato un modello ovino di sostituzione tracheale tessutale. L'innesto era composto da un misto di polietilene tereftalato (PET) e poliuretano dell'impalcatura elettrofilate (PU) seminati con cellule mononucleari derivate da midollo osseo (BM-MNC). In questo piccolo gruppo, abbiamo dimostrato che seminato autologo BM-MNC accelerata riepitelizzazione e stenosi⁵in ritardo. Sebbene la semina con autologo BM-MNC migliorata sopravvivenza, il meccanismo cellulare da cui BM-MNC modulano la formazione di tessuto funzionale rimane poco chiaro.

Indagine sullo sviluppo richiesto livello cellulare di un modello murino di tessuto ingegnerizzato sostituzione tracheale. Simile allo studio degli ovini, abbiamo utilizzato un ponteggio elettrofilate PET:PU seminato con BM-MNCs. coerentemente con il modello ovino, stenosi TETG sviluppato nel corso delle prime due settimane dopo l'impianto^{1,2,3 ,5}. Ciò ha suggerito che il modello murino ha ricapitolato la patologia osservata in precedenza, che ci permette di interrogare ulteriormente i meccanismi cellulari alla base di stenosi della via aerea.

In questo rapporto, abbiamo dettaglio il nostro protocollo per ingegneria tessutale sostituzione trachea nel modello del topo tra cui impalcatura produzione, isolamento BM-MNC, innesto semina e l'impianto (Figura 1, Figura 2).

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) all'ospedale dei bambini a livello nazionale.

1. produzione di ponteggio

1. Preparare una soluzione di precursore nanofibre polimeriche di: 1) dissoluzione 8 wt % PET in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol e riscaldamento la soluzione a 60 ° C e sciogliendo 2) 3 wt % PU in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol a temperatura ambiente.
2. Una volta raffreddato, combinare le soluzioni per creare una miscela polimerica finale di PET e PU (20: 80).
3. Electrospin la soluzione di PET+ PU su un tondino di acciaio inox (1 mm di diametro) che utilizza un ago di punta smussata 20 G su una siringa da 60 mL riempita con la soluzione di PET:PU utilizzando un set di alimentazione DC ad alta tensione a + 14 kV sull'ago, un altro alimentatore di alta tensione fornire insieme a -3 kV , una portata di 5 mL/h e una distanza di 20 cm punta al substrato. Ruotare l'asta a 350 giri/min durante la deposizione di fibra.
4. Continuare elettrofilatura fino ad ottenere lo spessore desiderato impalcatura di 300 µm. Far scorrere il patibolo dallo stelo, poi tenerlo sotto vuoto durante la notte per rimuovere qualsiasi residuo solvente.
5. Sterilizzare l'impalcatura usando un dosaggio di luce ultravioletto di 350 mJ/cm² prima dell'impianto.

2. raccolta di cellule mononucleate derivate da midollo osseo (BM-MNC)

1. Eutanasia di un 6-8 settimane vecchio, femmina, C57BL/6 mouse con un cocktail di ketamina (200 mg/kg), xilazina (20 mg/kg) e ketoprofene (10 mg/kg). Verifica per l'eutanasia completo di coda-pizzico metodo. Assicurarsi di seguire le linee guida locali per l'eutanasia.
2. In condizioni di sterilità, togliere la pelle sopra i femori e le tibie per esporre osso usando forbici fini e micro-Adson da. Utilizzare Dumont #5 forcipe e forcipe Dumont #5/45 per rimuovere la fascia e i tendini. Separare le ossa e tagliare ciascuno di essi su entrambe le estremità. Usando una siringa da 5 mL e un ago 25G, filo del midollo osseo in una piastra Petri contenente 30 mL di media di Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Filtrare questo RPMI con midollo osseo attraverso un colino di cella di 70 µm in nylon in una provetta da 50 mL.
3. In un armadio di sicurezza biologica, versare 5 mL di diatrizoate polysurcrose e sodio in una provetta da 15 mL. Aggiungere delicatamente il RPMI contenente cellule mononucleari del midollo osseo lungo il lato del tubo per evitare il mescolamento dei due strati. Centrifuga a 461 x g per 30 min con "freno 1" a 24 ° C.
   Nota: Su nostra centrifuga, banchi freno 1 per la più lunga esaurito tempo durante la decelerazione.
4. Fuori i tre strati formati, eliminare lo strato superiore (rosa) del plasma e raccogliere lo strato intermedio (chiaro), costituito da cellule mononucleari del midollo osseo. Eliminare il precipitato di globuli rossi.
5. Diluire le cellule mononucleari del midollo osseo (BM-MNC) in tampone fosfato salino (PBS) in un rapporto 1:1 e centrifugare a 461 x g per 10 min con "freno 9" a 24 ° C.
6. Rimuovere il supernatante e diluire il pellet con 5 mL di PBS. Centrifuga a 461 x g per 10 min con "freno 9" a 24 ° C.
7. Rimuovere il supernatante e diluire il pellet con ~ 10 mL di RPMI.
8. Diluire 10 µ l della soluzione BM-MNC con un volume uguale di 0,4% trypan blu in una provetta 1 mL. Posto 10 µ l della soluzione in una cella conteggio diapositiva di camera. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Ripetere il passaggio e calcolare il numero medio di cellule.
   Nota: Un numero medio di 1 X 10⁸ celle è stato ottenuto dall'utilizzo di due topi di donatore. Questo sarebbe equivalente a due femori e due tibie che nel midollo osseo è isolato da.
9. Centrifugare la soluzione di BM-MNC a 461 x g per 10 min con "Freno 9" a 24 ° C. Rimuovere il supernatante e diluire la concentrazione cellulare di 10⁷ cellule/innesto.
   Nota: Abbiamo studiato semina efficienza tra 1, 10 e 100 milioni di cellule e scoperto che 10 milioni di cellule per innesto produce la più alta efficienza di semina.

3. semina sugli innesti cellulare

1. Misurare le lunghezze delle impalcature e se necessario, tagliateli ad una lunghezza di 5 mm.
2. Pre-bagnato il patibolo con 5 µ l di RPMI per 5 min, Rimuovi il RPMI.
3. Aggiungere 5 µ l della soluzione BM-MNC al lumen dell'impalcatura per 10 min.
4. Passare un ago 21G attraverso il lume dell'innesto e incubare l'innesto a 1000 µ l di RPMI durante la notte a 37 ° C in un incubatore.

4. l'impianto dell'innesto

Nota: Si dovrebbe prestare attenzione a mantenere una tecnica asettica durante la procedura di impianto dell'innesto.

1. Utilizzare 6-8-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 come destinatari per gli innesti delle cellule seminate. Iniettare enrofloxacina (10mg/kg) per via sottocutanea 24 h prima dell'intervento chirurgico e prima incisione.
2. Pesare il mouse e somministrare una dose di 0,1 mL/10 g del cocktail anestetico di ketamina (100 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) e ketoprofene (5 mg/kg) come analgesia per via intraperitoneale.
3. Verifica se il piano dell'anestesia è stato raggiunto dal metodo di coda-pizzico. Confermando il livello di sedazione, applicare una pomata oftalmica sterile agli occhi e i capelli sul sito chirurgico dal mento alla clavicole di clip. Metti l'animale su un pad in una posizione recumbent dorsale. Disinfettare il sito chirurgico prima tramite un pad prep povidone-iodio, seguita da un tampone di preparazione di alcool (70% di alcol) e ancora una volta un pad di preparazione di povidone-iodio.
4. Metti l'animale sotto il microscopio per dissezione con la sua testa dal chirurgo. Fare un'incisione del midline che vanno da clavicole fino all'osso ioide con l'aiuto di forbici fini e micro-Adson da. Pulire la fascia con Dumont #5 e una pinzetta Dumont n. 7, insieme con un tampone di cotone sterile, se necessario e inserire un retrattore diconservazione del Colibri.
5. Aprire i muscoli della cinghia (Figura 3A) con Dumont #5 e #7 Dumont una pinzetta per esporre la cartilagine tiroidea, la cartilagine cricoide e la trachea. Senza mezzi termini di separare la trachea dai nervi laringei ricorrenti in esecuzione parallela su entrambi i lati, seguito dalla separazione della circonferenza della trachea dall'esofago (Figura 3B).
6. Utilizzando un ago di 20G e marcatore chirurgico, macchia la porzione anteriore della trachea.
7. Identificare la trachea e fare un'incisione sotto il terzo anello di cartilagine tracheale e transetto la trachea con un paio di forbici di primavera di Allerød-Tubingen e una coppia di Dumont #7 una pinzetta. Tenendolo con il forcipe curvo fine, fissare la trachea distale allo sterno utilizzando sterile sutura in nylon 9-0 per creare un tracheostomy provvisorio (Figura 3C). Nota: Un materiale di sutura alternativo che può essere utilizzato è il PDS di 9-0 per reapproximation l'impianto e muscolo tracheale.
8. Con un ago di 20G e un marcatore chirurgico, macchia l'innesto per rappresentare la parte anteriore.
9. Impiantare l'innesto inserimento prossimale-posteriore, laterale prossimale e suture prossimale anteriore, in questo ordine usando i suturare di nylon sterile 9-0 (Figura 3D), Dumont #7 pregiati forcipe e un porta-aghi.
10. Ruotare l'animale 180° per posizionare la coda dal chirurgo. Rilasciare il tracheostomy provvisorio. La trachea distale in modo incompleto è attraversata per permettere l'utilizzo del segmento resecato come un ceppo per ritrazione. Quando non più necessario, è possibile che il segmento di trachea 5 MM viene rimosso completamente.
11. Completare l'anastomosi distale ponendo le suture in modo simile come l'anastomosi prossimale.
12. Ri-circa la posizione di innesto e i muscoli della cinghia. Chiudere l'incisione utilizzando suture sterili in nylon 9-0 in un modello in esecuzione.
13. Iniettare 0,1 mL di buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea e metti l'animale in una gabbia di recupero collocata su un rilievo di riscaldamento senza altri animali in gabbia.
14. Osservare il mouse fino a quando non è cosciente e in grado di deambulare, quindi trasferire il mouse a una nuova gabbia con biancheria morbida, umida chow e acqua medicata (ibuprofene, 30 mg/kg) per 48 h. Dopo questo periodo di tempo, tornare il mouse una gabbia normale con altri topi.
    Nota: Topi che mantengono l'afflizione respiratoria o attività in diminuzione dopo l'impianto sono osservati dal personale di laboratorio e/o animale in un incubatore a 32 ° C. Se il problema persiste per più di 48 h, poi i topi dovrebbero essere euthanized.

5. istologia ed immunoistochimica

Nota: Le macchie dell'eosina e sono state eseguite utilizzando la tecnica standard di ospedale morfologia Core bambini a livello nazionale. Immunohistochemistry è stato effettuato secondo la seguente procedura.

1. Deparaffinizzare le diapositive utilizzando 1) xilene per 5 min, 2) xilene per 5 min, 3) 100% etanolo per 5 min, 4) 90% etanolo per 5 min, 5) 70% di etanolo per 5 min, 6) distillato di H₂O (dH₂O) per 5 min.
2. Immergere i vetrini in tampone citrato e mettere in pentola a pressione piena d'acqua. Riscaldare per 10 minuti, poi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Lavare con albumina di siero bovino 0,1% in PBS (BSA-PBS) per 5 min. risciacquo con dH₂O.
   Nota: Riscaldamento può avvenire anche con una vasca di acqua calda o forno a microonde per 15 min.
3. Incubare i vetrini con siero di capra normale 3% in PBS per 1 h a temperatura ambiente. Lavare con 0.1% BSA-PBS per 5 min. Incubare in anticorpo primario con le concentrazioni per la cheratina 5 (1: 1000)⁶, cheratina 14 (1: 250)⁶ e F4/80 (1: 100)⁷ per 18 h durante la notte a 4 ° C.
4. Lavare con 0.1% BSA-PBS due volte per 10 min ciascuno lavare. Incubare con l'anticorpo secondario appropriato alla concentrazione di 1: 500 per K5/K14 e 1: 300 F4/80 per 1 h a temperatura ambiente. Lavare con 0.1% BSA-PBS due volte per 10 min ciascuno lavare.
5. Montaggio tramite 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) contenente montaggio media e vetro vetrini coprioggetto. Lasciar per riposare per 30 min prima di formazione immagine.

Risultati

La figura 1 illustra uno schema di TETG semina e l'impianto. Midollo osseo è stato raccolto dai topi C57BL/6 e coltivate in vitro. BM-MNC sono stati isolati mediante centrifugazione di densità e seminate sul TETG. TETGs teste di serie sono stati impiantati in un syngeneic del topo destinatario C57BL/6.

Figura 2 è una panoramica dello scaffold PET:PU TETG pro...

Discussione

Sviluppo di un modello murino per i tracheas tessutale è essenziale nella comprensione dei fattori che hanno limitato la traslazione clinica TETGs; vale a dire dell'innesto crollo, stenosi ed epithelialization in ritardo⁴. Alcuni fattori che contribuiscono a queste limitazioni includono la selezione del materiale dell'innesto, il processo di fabbricazione, design di impalcatura e semina protocolli cellulare. Questo modello tiene conto la valutazione più veloce di questi fattori al fine di compre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium chloride injection	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-186-10
10cc serological pipet	Falcon	357551
18G 1.5in. Needle	BD	305190
1mL Syringe	BD	309659
24-well plate	Corning	3526
25cc serological pipet	Falcon	356535
25G 1in. Needle	BD	305125
50cc tube	BD	352070
Alcohol prep pads	Fisher Healthcare	NDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) solution	Bayer Healthcare, LLC	NDC 0859-2267-01
Black polyamide monofilament suture, 9-0	AROSurgical Instruments Corporation	T05A09N10-13
C57BL/6, female	Jackson laboratories	664	6-8 weeks old
Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate	ThermoFisher	5000
Colibri retractors	F.S.T	17000-04
Cotton tipped applicators	Fisher scientific	23-400-118
Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody	ThermoFisher	MA5-11599
Dumont #5 Forceps	F.S.T	11251-20
Dumont #5/45 forceps	F.S.T	11251-35
Dumont #7 - Fine Forceps	F.S.T	11274-20
F4/80 Rat anti-mouse antibody	Bio-Rad	MCA497R
Ficoll	Sigma	10831-100mL
Fine scissors- Sharp-blunt	F.S.T	14028-10
Fisherbrand Premium Cover Glasses	ThermoFisher	12-548-5M
Fluoroshield Mounting Media with DAPI	Abcam	ab104139
Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11001
Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-11012
Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647	ThermoFisher	A-21247
Ibuprofen	Precision Dose, Inc	NDC 68094-494-59
Iodine prep pads	Professional disposables international, Inc.	NDC 10819-3883-1
Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified	BioLegend	905501
Ketamine hydrochloride injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Micro-Adson forceps	F.S.T	11018-12
Microscope	Leica	M80
Non-woven sponges	Covidien	441401
Opthalmic ointment	Dechra Veterinary products	NDC 17033-211-38
PBS	Gibco	10010-023
PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds	Nanofiber solutions		Custom ordered
Petri dish	BD	353003
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875-093
TISH Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Trimmer	Wahl	9854-500
Vannas-Tübingen Spring Scissors	F.S.T	15008-08
Warm water recirculator	Gaymar	TP-700
Xylazine sterile solution	Akorn animal health	NDC 59399-110-20