توليف، الروغان، وتوصيف جسيمات نانوية مسامية السليكون فوسوجينيك لإيصال اليغنوكليوتيد

Summary

علينا أن نظهر توليف فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية لتسليم اليغنوكليوتيد في المختبر والمجراه في فعالية. جسيمات نانوية مسامية السليكون هي محملة siRNA النموذج الأساسية، التي هي مغلفة بالدهون فوسوجينيك عن طريق البثق لتشكيل shell. يتم تضمين استهداف مجموعة الروغان وتوصيف الجسيمات.

Abstract

ومع ظهور العلاج الجيني، أصبح تطوير نظام التسليم الفعال المجراة في النوكليوتيدات-حمولة الاستيراد الموازي. مؤخرا أظهرت فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) عالية الجيني المجراة في إسكات فعاليتها بسبب ما اليغنوكليوتيد عالية تحميل القدرات ومسار امتصاص الخلوية الفريدة التي تتجنب الالتقام. توليف بسينبس و هو عملية متعددة الخطوات تتضمن: (1) تحميل وختم حمولات اليغنوكليوتيد في المسام السليكون؛ (2) المتزامنة طلاء والتحجيم من الدهون فوسوجينيك حول النوى سليكون المليئة بالثغرات؛ والتصريف (3) استهداف الببتيدات والغسيل لإزالة اليغنوكليوتيد الزائدة والحطام السليكون الببتيد. التوحيد حجم الجسيمات تتسم بالديناميكية ونثر الضوء، ومن الممكن التحقق من بنيتها الأساسية-شل مجهر إلكتروني. يتم التحقق من امتصاص فوسوجينيك بتحميل محبتين صبغ، 1, 1 '-ديوكتاديسيل-3,3، 3', بيركلورات 3 '--تيتراميثيليندوكاربوسيانيني (دي)، إلى بلير دهن فوسوجينيك وعلاجها بالخلايا في المختبر لمراقبة لغشاء البلازما تلطيخ مقابل تعريب اندوسيتيك. تم قياس كمية بلغت إسكات الجينات الاستهداف والمجراه في سابقا في نموذج ماوس للالتهاب الرئوي من المكوّرات العنقودية الذهبية ، التي يتوقع الببتيد الاستهداف للمساعدة وبسينبس للصفحة الرئيسية لموقع الإصابة. بعد تطبيقه في المذهبة س. العدوى، يمكن استخدام النظام و بسينب لتسليم أي اليغنوكليوتيد للعلاج الجيني لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية.

Introduction

العلاج الجيني ينظم التعبير الجيني محددة الحصول على نتيجة العلاج. تم اكتشاف العديد من أدوات للتحوير الجيني ودراستها، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) باستخدام النوكليوتيد (مثلاً، قصيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)^1،2، ميكرورنا (ميرنا)^3،4 )، الحمض النووي والبلازميدات^5،6، نوكليسيس (مثلاً، إصبع الزنك، تالينس)^7،8، ونظم كريسبر/Cas9^9،10. بينما يختلف إليه كل أداة عمل، جميع الأدوات يجب أن تصل إلى السيتوبلازم للخلية أو النواة تكون نشطة. على هذا النحو، بينما أثبتت هذه الأدوات للحث على تأثير كبير على تحوير الجينات في المختبر، ونجاعة المجراة في تعاني من عقبات خارج الخلية وداخل الخلية. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الأدوات التي من أصل بيولوجي، العديد من الإنزيمات ونظم إزالة الألغام موجودة في الجسم التي لها القدرة على تخفيض أو إزالة الجزيئات الأجنبية¹¹. حتى في الحالة أن الأدوات التي تصل إلى الخلية المستهدفة، وأنهم يعانون من الالتقام؛ طريقة لامتصاص الخلوية التي تقوم بتغليف والفخاخ الأدوات الموجودة في حويصلات تشبه المعدة الحمضية التي تتحلل أو طرد أدوات الخروج من الزنزانة. في الواقع، لقد أظهرت الدراسات أن الدهون جسيمات نانوية المبتلعة عن طريق ماكروبينوسيتوسيس، التي هي اكسوسيتوسيد حوالي 70% من siRNA من الخلايا ضمن ح 24 لاستيعاب^12،13. غالبية siRNA المتبقية هي المتدهورة من خلال المسار الليزوزومية، وفي نهاية المطاف تحقيق فقط 1-2% من siRNA في البداية يدخل الخلية التي تحتوي جسيمات نانوية الهروب اندوسومال الخضوع يحتمل أن تكون [رني]^13،14 .

وقد وضعنا مؤخرا فوسوجينيك السليكون مسامية جسيمات نانوية (F-بسينبس) التي أساسية محملة siRNA تتألف من جسيمات نانوية السيليكون المليئة بالثغرات، و شل دهن فوسوجينيك¹⁵. واو-بسينبس يقدم ثلاث مزايا رئيسية على أنظمة إيصال اليغنوكليوتيد التقليدية الأخرى: (1) دهن فوسوجينيك الطلاء التي تمكن الجسيمات تجاوز الالتقام وتسليم الحمولة كاملة مباشرة في السيتوبلازم الخلية (مقابل % 1-2 يتحقق بالجسيمات المبتلعة^13،14) (الشكل 1)؛ (2) تحميل siRNA في بسينبس أسلحة عالية (> 20 و % مقارنة بوزن 1-15% من النظم التقليدية)¹⁵، والتي تتحلل سريعاً في السيتوبلازم (بمجرد إلقاء الجسيمات الأساسية للطلاء الدهني عن طريق امتصاص فوسوجينيك) لإطلاق سراح siRNA؛ و (3) استهداف تصريف الببتيد لاستضافة أكثر انتقائية للمطلوب أنواع الخلايا الحية في.

وقد أثبت نظام بسينب و الجينات كبيرة إسكات فعالية (> 95% في المختبر؛ > 80% المجراة في) وتأثير العلاجية اللاحقة في طراز ماوس قاتلة من الالتهاب الرئوي في المذهبة س. ؛ النتائج التي تم نشرها سابقا¹⁵. ومع ذلك، يتطلب البنية المعقدة للنظام و بسينب معالجة دقيقة وصقل الأمثل لتوليد جسيمات نانوية موحدة ومستقرة. وهكذا، والغرض من هذا العمل تقديم بروتوكول شامل، فضلا عن استراتيجيات التحسين للتوليف والروغان، ووصف واو-بسينبس لاستخدامها في إيصال المستهدفة من سيرناس لتأثير إسكات الجينات القوية.

Protocol

1-تجميع جسيمات نانوية مسامية السيليكون (بسينبس)

تنبيه: كن حذراً دائماً عند العمل مع حمض الهيدروفلوريك (HF). اتبع جميع أدلة الأمان وفقا لورقة بيانات السلامة به (SDS) والتعامل مع أي المواد الكيميائية التي تحتوي على التردد في غطاء دخان، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية؛ وقفازات مزدوج مع قفازات بوتيل في الخارج، ساحة بوتيل مع معطف مختبر تحتها، الوجه درع مع نظارات واقية تحت). جميع جامعات ومختبرات البحث والتطوير يتطلب تدريب خاص على السلامة HF قبل الاستخدام. لا تحاول أن تعمل مع التردد دون الموافقة المسبقة الخاصة بك منسق سلامة المختبرات المحلية، التي تلزم بتدابير إضافية للسلامة لا الموصوفة هنا.

1. إعداد الحلول النقش
   1. لجعل الحل HF 3:1 للنقش (المستخدمة في خطوات 1.3 و 1.4)، تعبئة من بلاستيك تخرج الاسطوانة مع 30 مل من مائي 48% التردد و 10 مل من الإيثانول المطلق (EtOH). الحل يجب أن تكون مضمنة في المواد البلاستيكية عالية الكثافة (مثل، الكثافة)، كما يذوب HF الزجاج.
   2. جعل 01:29 تخرج الحل التردد لانطلاقة (المستخدمة في الخطوة 1، 5)، تعبئة البلاستيك اسطوانة مع 1 مل من مائي 48% HF ومل 29 من الإيثانول المطلقة. الحل يجب أن تكون مضمنة في المواد البلاستيكية عالية الكثافة (مثل، الكثافة)، كما يذوب HF الزجاج.
   3. جعل الحل كوه م 1 في 10% EtOH لانحلال هذه المبادرة الزائدة (المستخدمة في "الخطوات 1-3" و 1، 5).
2. إعداد الخلية أحفر
   1. في تفلون أحفر الخلية مع سم 8.6² أحفر جيدا (منطقة يتم حسابه بقياس قطر سطح السليكون المتوفرة للحفر داخل يا الدائري، وحساب المجال بألف = πr²)، وضع بترتيب تنازلي (الشكل 2a): (1) تفلون الخلية أعلى؛ (2) الدائري؛ (3) قطعة ربع من بلورة أحادية (1 0 0)-توجه ف + +-نوع السيليكون رقاقة مقطعة أرباع (باستخدام قاطع الماس)؛ (4) رقائق الألومنيوم؛ و (5) تفلون الخلية الأساسية مع مسامير بلطف تشديد الإجراءات لمنع التسرب.
   2. سد البئر مع EtOH. مسح وإدراج في الشق بين أعلى الخلية تفلون وقاعدة. إذا كان المسح الجاف عند إزالة، الخلية أحفر مختومة. إذا تسرب الرطب، الخلية، وتشديد الخناق كذلك حتى مختومة.
3. اليكتروبوليشينج رقاقة السيليكون
   1. جلب الخلية أحفر المجتمعون في غطاء دخان.
   2. سد البئر مع 10 مل من محلول HF 3:1.
   3. الاتصال زمام المبادرة الإيجابية لرقائق الألومنيوم (الكهربائي) من الخلية أحفر والاتصال تؤدي سلبية اللولب البلاتين (مكافحة القطب) منغمسين في حل الخلية أحفر لإكمال الدائرة (الشكل 2) HF 3:1.
   4. تشغيل ثابت الحالية في mA 50 سم^-2 ل 60 ثانية. مرة أحفر انتهى، إزالة الخلية من الدارة، وشطف خارج التردد 3:1 بعناية باستخدام المحاقن. شطف مع EtOH ثلاث مرات.
   5. حل بعيداً من طبقة محفوراً بسد البئر ببطء مع 10 مل من 1 م كوه. انتظر حتى تهدأ السطح.
   6. شطف من كوه بالماء ثلاث مرات، ومن ثم مع EtOH ثلاث مرات.
4. اليكتروتشيميكالي النقش طبقات مسامية في رقاقة السيليكون
   1. تشغيل تيار المتردد من الموجي مربعة، مع current density أقل من 50 mA/سم² ل 0.6 s وعالية الكثافة الحالية من 400 mA/سم² ل 0.36 s متكررة لدورات 500.
   2. مرة أحفر انتهى، إزالة الخلية من الدارة، وشطف خارج التردد 3:1 بعناية باستخدام المحاقن. شطف مع EtOH ثلاث مرات.
5. رفع قبالة الطبقة المسامية من رقاقة السيليكون
   1. سد البئر مع 10 مل من 01:29 الحل التردد.
   2. تشغيل ثابت من 3.7 mA/سم² 250 s. مرة أحفر انتهى، إزالة الخلية من الدائرة. الطبقة هذه المبادرة قد تظهر تموجات تشير إلى مفرزة من رقاقة السيليكون البللوري. بلطف تغسل 01:29 الحل التردد وشطف مع EtOH ثلاث مرات، ثم مع الماء ثلاث مرات.
   3. استخدام تلميح ماصة، إيمانا راسخا صدع محيط الطبقة هذه المبادرة لمفرزة كاملة. استخدام EtOH، جمع شظايا هذه المبادرة (رقائق) من تفلون أحفر الخلية في قارب وزنها. نقل الرقائق لقنينة زجاج. يمكن الإبقاء على الرقائق هذه المبادرة في درجة حرارة الغرفة في EtOH لأكثر من 6 أشهر للتخزين.
   4. حل أي السيليكون المليئة بالثغرات المتبقية في يفر بعيداً عن طريق ملء البئر ببطء مع 10 مل من 1 م كوه. انتظر حتى تهدأ السطح.
   5. شطف من كوه بالماء ثلاث مرات، ومن ثم مع EtOH ثلاث مرات.
   6. كرر الخطوات من 1.3-1.5 حتى سمك يفر كاملة قد تم محفوراً.
6. سونيكاتينج طبقات مسامية لتشكيل نانوحبيبات
   1. استبدال المذيبات القنينة الزجاجية التي تحتوي على رقائق هذه المبادرة من EtOH إلى 2 مل مياه دي.
   2. بشدة إغلاق الغطاء، وختم باستخدام بارافيلم.
   3. مكان الزجاج فيال في حمام سونيكاتور وعلقت أن حجم رقائق هذه المبادرة هو تماما المغمورة تحت سطح الأرض.
   4. Sonicate على ح 12 35 كيلو هرتز وطاقة الترددات اللاسلكية من 48W. لمنع فقدان الماء كبيرة أثناء سونيكيشن، ضع قارورة حجمي مملوءة بالمياه، مقلوب حيث أن فتح قارورة يمس سطح حمام الماء.
   5. ضع قنينة الزجاج على سطح مستو ح 1 للسماح للجسيمات الأكبر حجماً لتسوية في الجزء السفلي. جمع المادة طافية ماصة؛ باستخدام ويتضمن التعليق بسينبس sub-100 نانومتر.

2-إعداد فيلم الدهن فوسوجينيك

1. إعداد الحلول الدهن المخزون
   1. في غطاء دخان، جعل الأرصدة 10 ملغ/مل من الدهون بترطيب دمبك، دسب-شماعة-القانون النموذجي للتحكيم والدهون دوتاب في كلوروفورم. يمكن الإبقاء على هذه الحلول الأسهم في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر تحت ختم بارافيلم ضيق.
2. جعل الفيلم الدهن فوسوجينيك
   ملاحظة: تكوين فوسوجينيك مصنوع من الدهون، دمبك، دسب-الوتد، ودوتاب، في نسبة المولى 76.2:3.8:20 و 96.2:3.8:0، على التوالي.
   1. في قنينة زجاجية، مزيج ميكروليتر 72.55 دمبك وقدرة 15.16 ميكروليتر من شماعة دسب 19.63 ميكروليتر من دوتاب من بيبيتينج.
   2. اختياري: لوضع العلامات الفلورية الطلاء الدهن، بالإضافة إلى ذلك إضافة 20 ميليلتر من دي حله في EtOH بتركيز 1 ملغ/مل.
   3. مكان القنينة في غطاء دخان مع غطاء فضفاض للسماح كلوروفورم تتبخر بين ليلة وضحاها. وسيكون الفيلم المجففة مادة هلام مثل الصلب غائم في أسفل القنينة.

3-تحميل وختم من siRNA في بسينبس

1. إعداد كلوريد الكالسيوم تحميل المخزون
   1. حل ز 1.11 من كاكل₂ في 10 مل مياه خالية من رناسي لجعل حل₂ كاكل م 2.
   2. الطرد المركزي الحل > 10 آلاف س ز لمدة 1 دقيقة لتسوية المجاميع وجمع المادة طافية باستخدام ماصة. بدلاً من ذلك، قم بتصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
2. إعداد siRNA تحميل المخزون
   1. هيدرات أو تمييع siRNA إلى 150 ميكرومتر في المياه خالية من رناسي. قد يكون اليكووتيد هذا الحل الأسهم وتبقى مجمدة في-20 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل نظراً لأن فإنه لا تخضع لدورات تجميد أذاب متكررة.
3. تحميل siRNA في بسينبس مع كلوريد الكالسيوم
   1. إعداد حمام سونيكيشن مثلج.
   2. تحت 15 دقيقة ultrasonication ولطف ماصة 150 ميليلتر من siRNA وميليلتر 700 م 2 كاكل₂ إلى 150 ميليلتر من بسينب. تأكد من ترك غطاء أنبوب ميكروسينتريفوجي مفتوحة لتوليد الغاز.
   3. إزالة أنبوب يحتوي على 1 مل بسينبس الكالسيوم محملة siRNA المغلفة من سونيكاتور.

4-طلاء بسينبس siRNA المحملة بالدهون فوسوجينيك

1. إعداد مواد البثق الحويصلية
   1. ملء كوب واسعة مع المياه دي. غشاء البولي 1 النقع (200 نانومتر المسام)، ويدعم تصفية 4 التي تطفو بها على سطح الماء. تجميع عدة البثق الحويصلية باتباع إرشادات الشركة المصنعة
2. ترطيب الفيلم الدهن مع تحميل siRNA بسينبس
   1. هيدرات الدهن المجففة الفيلم في القنينة الزجاج مع 1 مل من بسينبس الكالسيوم محملة siRNA المغلفة التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.3.3. "الماصة؛" حتى جميع الدهون الفيلم قد رفع من أسفل القنينة ومختلطة في حل متجانسة الملبدة بالغيوم.
   2. وضع شريط إثارة مغناطيسية في قنينة الزجاج ثم ضع القنينة على لوحة الساخن لتسخين الجسيمات إلى 40 درجة مئوية (أو مرتفع ما يكفي أعلاه المرحلة درجة حرارة الدهون التحول الاحتفاظ الدهون في مرحلة فلويديك أكثر البلورات السائلة) بينما مغناطيسيا إثارة الحل لمدة 20 دقيقة.
3. البثق بسينبس المغلفة بالدهن للتحكم في حجم
   1. نضح 1 مل الحل المغلفة بدهن بسينب-siRNA في المحاقن النتوء. إدراج المحاقن فارغة على أحد جانبي الطارد، والمحاقن شغلها على الطرف الآخر.
   2. يبدأ قذف بدفع المكبس ببطء لدفع الجسيمات من حقنه واحدة، عبر غشاء البولي، وفي الأخرى. كرر 20 مرة. إذا عالق المكبس، عامل التصفية والغشاء قد يكون انسداد. تفكيكه في الطارد واستبدال يدعم الغشاء والتصفية. إذا استمرت المشكلة، تمييع الجسيمات حتى انسداد يمكن التحكم فيها.
   3. جمع جزيئات البوليستيرين في أنبوب ميكروسينتريفوجي.

5-تصريف استهداف الببتيدات

1. التصريف الببتيد الاستهداف لطلاء دهني
   1. إعداد المخزون الببتيد مع 1 ملغ/مل تركيز الببتيد في المياه خالية من رناسي.
   2. في أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على فوسوجينيك بسينبس المغلفة بالدهن، إضافة 100 ميليلتر من مخزون الببتيد 1 ملغ/مل وبيبيت بلطف. الاحتفاظ بالانبوب ثابتة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة (بدلاً من ذلك، > 2 ح في 4 درجات مئوية).
   3. لإزالة الزائدة الببتيد أو siRNA وأخرى سواغ، يغسل في عامل تصفية الطرد مركزي كاتشين 30 من الغزل في 5,000 س ز عند 25 درجة مئوية حاء 1 أكثر من مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني تحت نفس إعداد أجهزة الطرد المركزي.
   4. ريسوسبيند بسينبس المغلفة بدهن فوسوجينيك مترافق الببتيد النهائية في برنامج تلفزيوني في التركيز المطلوب. الآن يمكن الجسيمات اليكووتيد والمجمدة في-80 درجة مئوية للتخزين لمدة 30 يوما على الأقل.

النتائج

توليفة ناجحة من بسينبس فوسوجينيك وينبغي التوصل إلى حل متجانسة، مبهمة بعض الشيء (الشكل 3a). الفشل في تحسين نسبة وتركيز بسينبس: siRNA: كاكل₂ قد يؤدي إلى التراكم عند تحميل (الشكل 3b). كما هي مقذوف الجسيمات من خلال 200 نانومتر الأغشية، قطر بسينبس...

Discussion

ويرد توليف لجسيمات نانوية مسامية السليكون في الشكل 5. الخطوة الحاسمة في تركيب بسينبس فوسوجينيك في تحميل الخطوة (الخطوة 3). إذا كان يتم تجميع جسيمات نانوية فوسوجينيك بعد توليف (الشكل 3)، والسبب قد يكون بسبب ما يلي: (1) كلوريد الكالسيوم المخزون لم يعد المتجانس، و?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015