Synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de nanoparticules de silicium poreux Fusogène pour la livraison de l’oligonucléotide

Résumé

Nous démontrons la synthèse de nanoparticules de silicium poreux fusogène pour livraison efficace oligonucléotide in vitro et in vivo. Nanoparticules de silicium poreux sont chargés avec des siARN pour former le noyau, qui est recouvert par les lipides fusogène par extrusion pour former la coquille. Ciblage portion fonctionnalisation et caractérisation des particules sont inclus.

Résumé

Avec l’avènement de la thérapie génique, le développement d’un système de livraison efficace in vivo nucléotide-charge utile est devenu d’importation parallèle. Nanoparticules de silicium poreux Fusogène (F-pSiNPs) ont récemment démontré des gènes in vivo haute silence efficacité en raison de sa haute oligonucléotide chargement de capacité et la voie d’absorption cellulaire unique qui évite l’endocytose. La synthèse de F-pSiNPs est un processus multi-étapes qui comprend : (1) chargement et la fermeture des oligonucléotides charges utiles dans les pores de silicium ; (2) simultanée de revêtement et de dimensionnement des lipides coniques autour les carottes de silicium poreux ; et (3) la conjugaison de ciblage de peptides et de lavage pour éliminer les excès oligonucléotide, débris de silicium et le peptide. Uniformité de taille de la particule se caractérise par la diffusion dynamique de la lumière, et sa structure de noyau-enveloppe peut être vérifiée par microscopie électronique à transmission. L’absorption de fusogène est validée en chargeant un lipophile teindre, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), dans la bicouche lipidique fusogène et traitant aux cellules in vitro d’observer pour la coloration par rapport à la membrane plasmique localisations endocytose. L’efficacité de silencieux de gène ciblage et in vivo ont été quantifiées précédemment dans un modèle murin de pneumonie à Staphylococcus aureus , dans lequel le peptide de ciblage devrait aider le F-pSiNPs à domicile pour le site de l’infection. Au-delà de son application dans l’infection à Staphylococcus aureus , le système F-pSiNP peut servir à livrer un oligonucléotide pour la thérapie génique d’un large éventail de maladies, y compris les infections virales, le cancer et les maladies auto-immunes.

Introduction

Thérapie génique module l’expression de gènes spécifiques afin d’obtenir un résultat thérapeutique. Nombreux outils pour la modulation de gène ont été découverts et étudiés, y compris l’acide ribonucléique interférence (Arni) utilisant des oligonucléotides (p. ex., court interférence ARN (siRNA)^1,2, microARN (miARN)^3,4 ), ADN plasmides^5,6, nucléases (p. ex., doigt de zinc, TALENS)^7,8et CRISPR/Cas9 systèmes^9,10. Alors que le mécanisme de chaque outil d’action est différent, tous les outils doivent parvenir à cytoplasme de la cellule ou le noyau actif. Ainsi, alors que ces outils se sont avérés pour induire un effet significatif dans la modulation de l’expression génique in vitro, l’efficacité in vivo souffre d’obstacles extracellulaires et intracellulaires. Dû au fait que les outils sont d’origine biologique, plusieurs enzymes et les systèmes d’autorisation existent dans notre corps qui ont la capacité de dégrader ou de supprimer les molécules étrangères¹¹. Même dans le cas que les outils atteignent la cellule cible, ils souffrent d’endocytose ; un mode d’absorption cellulaire qui encapsule et emprisonne les outils dans les vésicules d’estomac comme acides qui se dégradent ou expulser les outils hors de la cellule. En fait, les études ont montré que les nanoparticules lipidiques sont mégacaryocyte via macropinocytose, dont environ 70 % de des siARN sont exocytosed des cellules dans les 24h d’absorption^12,13. La majorité des siARN restant est dégradée par la voie lysosomiale, et en fin de compte que 1 à 2 % des siARN qui initialement pénètre dans la cellule avec les nanoparticules atteindre évasion endosomal potentiellement subir Arni^13,14 .

Nous avons récemment développé des nanoparticules de silicium poreux fusogène (F-pSiNPs) qui ont un noyau chargés en siARN composé de nanoparticules de silicium poreux et un fusogène lipides coquille¹⁵. Les F-pSiNPs présente trois avantages majeurs sur les autres vecteurs d’oligonucléotide classiques : (1) un lipide fusogène revêtement qui permet aux particules de contourner l’endocytose et distribuer la surcharge ensemble directement dans le cytoplasme des cellules (contre le 1-2 % réalisé par mégacaryocyte particules^13,14) (Figure 1) ; (2) haute emplissage de siARN dans la pSiNPs (> 20 % en poids par rapport à 1-15 % en poids par les systèmes conventionnels)¹⁵, qui dégradent rapidement dans le cytoplasme (une fois que les particules de base versé la couche lipidique via fusogène absorption) pour libérer le siARN ; et (3) ciblant la conjugaison de peptide pour domiciliation sélective à désiré types cellulaires in vivo.

Le système F-pSiNP a démontré le silençage efficacité de gènes importants (> 95 % in vitro ; > 80 % in vivo) et un effet thérapeutique ultérieur dans un modèle de souris mortel de pneumonie à Staphylococcus aureus ; les résultats qui ont été publiées auparavant¹⁵. Cependant, la structure complexe du système F-pSiNP suppose une manipulation délicate et optimisation adaptée pour générer des nanoparticules homogène et stables. Ainsi, le but de ce travail est de présenter un protocole complet, ainsi que des stratégies d’optimisation pour la synthèse, fonctionnalisation et caractérisation de F-pSiNPs à utiliser dans l’administration ciblée des siRNAs pour un effet puissant gène silencieux.

Protocole

1. synthèse de nanoparticules de silicium poreux (pSINPs)

Attention : Soyez toujours prudent lorsque vous travaillez avec de l’acide fluorhydrique (HF). Suivez tous les guides de sécurité selon sa fiche de données de sécurité (SDS), gérer les produits chimiques contenant du HF dans une hotte aspirante et porter les équipements de protection individuelle appropriés (PPE, gants doubles avec gants butyl sur l’extérieur, tablier de butyle avec blouse en dessous, visage protéger avec des lunettes de sécurité sous). Toutes les universités et les laboratoires de R & D nécessitent une formation spécifique sur la sécurité des HF avant utilisation. N’essayez pas de travailler avec HF sans l’approbation préalable de votre coordonnateur de sécurité laboratoire local, car les mesures de sécurité supplémentaires non décrites ici sont nécessaires.

1. Préparation des solutions de gravure
   1. Pour rendre la solution HF de 3:1 pour la gravure (utilisée dans les étapes 1.3 et 1.4), remplir un plastique gradué cylindre avec 30 mL de solution aqueuse HF de 48 % et de 10 mL d’éthanol absolu (EtOH). La solution doit figurer en plastique de haute densité (PEHD, par exemple), comme la HF dissout verre.
   2. Pour faire un 01:29 solution HF pour le décollage (utilisé en étape 1.5), combler un plastique gradué cylindre avec 1 mL de solution aqueuse HF de 48 % et 29 mL d’éthanol absolu. La solution doit figurer en plastique de haute densité (PEHD, par exemple), comme la HF dissout verre.
   3. Faire la solution KOH de 1 M 10 % EtOH dissolution excès lb/po2 (utilisé dans les étapes 1.3 et 1.5).
2. Mise en place de la cellule d’etch
   1. Dans un téflon etch cellule avec un 8,6 cm² etch bien (zone est calculé en mesurant le diamètre de la surface de silicium disponible pour gravure à l’eau-forte dans le joint torique et calcul de la surface par A = πr²), placez en décroissant ordre (Figure 2 a) : (1) le Haut de téflon de cellule ; (2) un joint torique ; (3) un morceau de quart du cristal unique (1 0 0) - orienté p ++ - type plaquette de silicium découpée en quartiers (en utilisant un diamond cutter) ; (4) d’aluminium ; et (5) la cellule de téflon base avec vis serrées doucement pour éviter les fuites.
   2. Remplir le puits d’EtOH. Prenez une lingette et insérer dans l’interstice entre le téflon cellule dessus et la base. Si la lingette est sec après le retrait, la cellule d’etch est scellée. Si humide, la cellule fuit et serrez les vis plus loin jusqu'à ce que le scellé.
3. Électropolissage la plaquette de silicium
   1. Amenez la cellule etch assemblé dans une hotte aspirante.
   2. Remplir le puits avec 10 mL de solution HF 3:1.
   3. Reliez le coté positif de la feuille d’aluminium (électrode) de la cellule d’etch et brancher la borne négative à la platine bobine (contre-électrode), immergée dans la solution de HF 3:1 de la cellule d’etch pour compléter le circuit (Figure 2 b).
   4. Exécuter un courant constant à 50 mA cm^-2 pendant 60 s. Une fois etch est terminé, retirer la cellule du circuit et rincer soigneusement à l’aide d’une seringue HF 3:1. Rincer avec EtOH trois fois.
   5. Dissoudre à la couche gravée en remplissant le puits lentement avec 10 mL de 1 M KOH. Attendez jusqu'à ce que le bouillonnement disparaisse.
   6. Rincez bien le KOH avec de l’eau trois fois, puis avec EtOH trois fois.
4. Gravure électrochimique couches poreuses en plaquette de silicium
   1. Exécuter une source de courant d’une onde carrée, avec current density inférieure de 50 mA/cm² pour 0,6 s et haute densité de courant de 400 mA/cm² pour 0,36 s répété pour 500 cycles.
   2. Une fois etch est terminé, retirer la cellule du circuit et rincer soigneusement à l’aide d’une seringue HF 3:1. Rincer avec EtOH trois fois.
5. Levage-hors de la couche poreuse de la plaquette de silicium
   1. Remplir le puits avec 10 mL de 01:29 solution HF.
   2. Exécuter une constante de 3,7 mA/cm² pour 250 s. Une fois etch est terminé, retirer la cellule du circuit. La couche pSi peut-être avoir des ondulations visibles indiquant le détachement de la plaquette de silicium cristallin. Doucement, nettoyez le 01:29 solution HF et rincer avec EtOH trois fois, puis avec de l’eau trois fois.
   3. À l’aide d’un embout de la pipette, crack fermement la circonférence de la couche de pSi pour le détachement complet. Vous utilisez EtOH, recueillir les fragments de lb/po2 (copeaux) du téflon etch cellule dans une barque de pesage. Transférer les puces dans un flacon de verre. Les puces de pSi peuvent être conservés à température ambiante dans EtOH pendant plus de 6 mois pour le stockage.
   4. Dissoudre à n’importe quel silicium poreux restant sur la plaquette en remplissant le puits lentement avec 10 mL de 1 M KOH. Attendez jusqu'à ce que le bouillonnement disparaisse.
   5. Rincez bien le KOH avec de l’eau trois fois, puis avec EtOH trois fois.
   6. Répétez les étapes 1,3-1,5 jusqu'à ce que l’épaisseur de la plaquette entière a été gravé.
6. Sonification couches poreuses pour la formation de nanoparticules
   1. Remplacer le solvant de la fiole de verre contenant des puces lb/po2 de EtOH à 2 mL de l’eau distillée.
   2. Bien refermer le bouchon et sceller à l’aide de parafilm.
   3. Placez le verre flacon dans un bain sonicateur et suspendu de telle sorte que le volume de copeaux de pSi est complètement submergé sous la surface.
   4. Laisser agir pendant 12 heures à 35 kHz et puissance de RF de 48W. Pour éviter toute perte d’eau importante pendant la sonication, placez une fiole jaugée remplie d’eau, inversé de sorte que l’ouverture du ballon touche la surface de l’eau du bain.
   5. Placer le flacon de verre sur une surface plane pendant 1 h permettre de plus grandes particules de s’installer au fond. Récupérer le surnageant à l’aide d’une pipette. la suspension contient pSiNPs sub-100 nm.

2. préparation du film lipidique fusogène

1. Préparation de la solution mère de lipides
   1. Sous une hotte, faire des stocks de 10 mg/mL de lipides en hydratant DMPC, DSPE-PEG-MAL et lipides DOTAP dans le chloroforme. Ces solutions mères peuvent être conservées à-20 ° C pendant 6 mois sous seing parafilm serré.
2. Réalisation du film lipidique de coniques
   Remarque : La composition fusogène faite des lipides, DMPC, DSPE-PEG et DOTAP, dans un rapport molaire de 76.2:3.8:20 et 96.2:3.8:0, respectivement.
   1. Dans un flacon en verre, mélanger 72.55 μL de DMPC, 15,16 μL de DSPE-PEG et 19.63 μL de DOTAP de pipetage.
   2. Facultatif : Pour le marquage fluorescent de la couche lipidique, en outre ajouter 20 µL de DiI dissous dans EtOH à une concentration de 1 mg/mL.
   3. Placer la fiole dans une hotte avec un bouchon lâche pour permettre le chloroforme s’évaporer du jour au lendemain. Le feuil sec sera une substance de type gel dure nuageuse au fond de la cuvette.

3. chargement et la fermeture des siARN dans pSiNPs

1. Préparation du chlorure de calcium chargement stock
   1. Dissoudre 1,11 g de CaCl₂ dans 10 mL d’eau exempte de RNAse pour faire une solution de₂ CaCl 2 M.
   2. Centrifuger la solution à > 10 000 x g pendant 1 min régler les agrégats et recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette. Vous pouvez également filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 µm.
2. Préparation des siARN chargement stock
   1. Hydrater ou diluer des siARN à 150 µM dans l’eau sans RNAse. Cette solution-mère peut être aliquotée et conservés congelée à-20 ° C pendant au moins 30 jours, étant donné qu’il ne subit pas de cycles de gel-dégel fréquents.
3. Chargement des siARN dans pSiNPs avec le chlorure de calcium
   1. Préparez un bain glacé sonication.
   2. Moins de 15 min ultrasonication, délicatement prélever 150 µL de siRNA et 700 µL de 2 M CaCl₂ dans 150 µL de pSiNP. Veillez à laissez le couvercle du tube microcentrifuge ouvert pour la production de gaz.
   3. Retirez le tube contenant 1 mL de calcium chargés en siARN enduit pSiNPs du sonicateur.

4. revêtement pSiNPs de siARN chargés avec des lipides fusogène

1. Préparation de la trousse d’extrusion de liposome
   1. Remplir un grand bécher avec l’eau distillée. Trempage en polycarbonate 1 membrane (pores de 200 nm) et 4 supports de filtre par eux flottant à la surface de l’eau. Assemblez les liposomes extrusion en suivant les instructions du fabricant
2. Hydratant le film lipidique avec siARN chargé pSiNps
   1. Hydrater le film lipidique séchées dans le flacon de verre avec 1 mL de pSiNPs de calcium chargés en siARN enduit obtenu à l’étape 3.3.3. Pipetter jusqu'à ce que tous les lipides film ont soulevé du fond de la cuvette et ont mélangé à une solution homogène nuageuse.
   2. Poser une barre magnétique dans le flacon de verre et placer le flacon sur une plaque chauffante pour chauffer les particules à 40 ° C (ou assez haut au-dessus de température de transformation de phase des lipides pour maintenir les lipides dans la phase cristalline liquide plus fluidique) tandis que magnétiquement en agitant la solution pendant 20 min.
3. Le pSiNPs de lipides enduit pour contrôle de la taille d’extrusion
   1. Aspirer le 1 mL de solution de lipides enduit pSiNP-siARN dans la seringue de l’extrusion. Insérer une seringue vide sur un côté de l’extrudeuse et la seringue remplie à l’autre extrémité.
   2. Extrusion de Begin en poussant sur le piston lentement pour les particules d’une seringue, à travers la membrane en polycarbonate et dans l’autre. Répétez 20 fois. Si le piston est coincé, la filtre et la membrane peuvent être obstrués. Démonter l’extrudeuse et remplacer les supports de la membrane et le filtre. Si le problème persiste, diluer les particules jusqu'à ce que l’obstruction est gérable.
   3. Recueillir les particules extrudées dans un tube de microcentrifuge.

5. conjugaison de ciblage des peptides

1. Conjugaison de peptide de ciblage pour revêtement de lipides
   1. Préparer le stock de peptide avec un 1 mg/mL de concentration de peptide dans de l’eau exempte de RNAse.
   2. Dans le tube de microcentrifuge contenant fusogène lipides enduit pSiNPs, ajouter 100 µL de 1 mg/mL de bouillon de peptide et pipette doucement. Maintenir le tube statiques à température ambiante pendant 20 min (alternativement, > 2 h à 4 ° C).
   3. Pour enlever les excès peptide ou siRNA et autres excipients, lavez dans un filtre centrifuge de 30 kDa par rotation à 5 000 x g à 25 ° C pendant 1 h. centrifugeuse deux fois plus avec 1 mL de PBS sous le même paramètre.
   4. Resuspendre le pSiNPs final fusogène peptide conjugué de lipides enduit dans du PBS à la concentration désirée. Les particules peuvent maintenant être aliquoté et congelé à-80 ° C pour le stockage d’au moins 30 jours.

Résultats

Une synthèse réussie des coniques pSiNPs devrait produire une solution homogène, légèrement opaque (Figure 3 a). Échec d’optimiser le ratio et la concentration de pSiNPs : siARN : CaCl₂ peut conduire à l’agrégation lorsqu’il se charge (Figure 3 b). Comme les particules sont extrudés à travers les 200 membranes nm, le diamètre moyen hydrodynamique de la pSiNPs fusogène mesurée par DLS devrait être ...

Discussion

Synthèse de nanoparticules de silicium poreux est illustrée à la Figure 5. L’étape critique dans la synthèse des pSiNPs coniques est à l’étape de chargement (étape 3). Si les nanoparticules fusogène agrégez post-synthèse (Figure 3), la raison peut être en raison de ce qui suit : (1) actions de chlorure de calcium ne préparait pas homogène, donc étape 3.1.2 doit être soigneusement suivi ou raffiné ; ou (2) le rapport de pSiNP : siARN : Ca...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015