Síntesis, funcionalización y caracterización de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para entrega de oligonucleótidos

Resumen

Demostramos la síntesis de nanopartículas de silicio poroso fusogénicas para la entrega eficaz de oligonucleótidos in vitro e in vivo. Nanopartículas de silicio poroso están cargadas de siRNA para formar el núcleo, que es cubierto por fusogénicas lípidos a través de la protuberancia para formar la cáscara. Funcionalización de parte de la segmentación y caracterización de partículas están incluidos.

Resumen

Con el advenimiento de la terapia génica, ha sido el desarrollo de un sistema de entrega de efectivo en vivo nucleótido-carga de importación paralela. Nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) recientemente han demostrado alta eficacia debido a su alta capacidad de cargamento y vía única absorción celular que evita la endocitosis de oligonucleótidos de silenciamiento del gen en vivo. La síntesis de F-pSiNPs es un proceso de múltiples paso que incluye: (1) de carga y sellado de cargas útiles de los oligonucleótidos en los poros de silicio; (2) simultánea capa y apresto de lípidos fusogénicas alrededor de los núcleos de silicio poroso; y (3) Conjugación de dirigidos a péptidos y lavado para eliminar exceso de oligonucleótidos, restos de silicio y péptidos. Uniformidad de tamaño de partícula se caracteriza por la dispersión ligera dinámica y su estructura de core-shell puede ser verificada por microscopía electrónica de transmisión. La absorción fusogénicas es validada por cargar un lipofílico del tinte, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), en el bilayer del lípido fusogénicas y tratar a las células in vitro para observar membrana de plasma versus la coloración endocíticas localizaciones. Previamente se cuantificaron los efficacies gene silenciamiento de segmentación e in vivo en un modelo murino de neumonía por Staphylococcus aureus en el targeting peptide se espera que a la F-pSiNPs a casa en el sitio de la infección. Más allá de su aplicación en S. aureus la infección, el sistema de F-pSiNP puede utilizarse para entregar cualquier oligonucleótidos para terapia del gene de una amplia gama de enfermedades, incluyendo infecciones virales, cáncer y enfermedades autoinmunes.

Introducción

Terapia génica modula la expresión del gen específico para obtener un resultado terapéutico. Numerosas herramientas para modulación de genes han sido descubiertos y estudiados, incluyendo el ácido ribonucleico de interferencia (ARNi) usando oligonucleótidos (por ejemplo, corta interferencia RNA (siRNA)^1,2, microRNA (miRNA)^3,4 ), ADN plásmidos^5,6, nucleasas (p. ej., dedo de zinc, TALENS)^7,8y CRISPR/Cas9 sistemas^9,10. Mientras que el mecanismo de la herramienta de acción es diferente, todas las herramientas deben alcanzar el citoplasma de la célula o el núcleo activo. Como tal, mientras que estas herramientas han demostrado para inducir un efecto significativo en la modulación de la expresión génica in vitro, la eficacia in vivo sufre obstáculos extracelulares e intracelulares. Debido a que las herramientas son de origen biológico, muchas enzimas y sistemas de separación existen en nuestro cuerpo que tienen la capacidad para degradar o eliminar los extranjeros moléculas¹¹. Incluso en el caso que los instrumentos lleguen a la célula diana, sufren de endocitosis; un modo de absorción celular que encapsula y atrapa las herramientas en vesículas de estómago como ácidas que degradan o expulsan las herramientas fuera de la célula. De hecho, estudios han demostrado que las nanopartículas lipídicas son endocytosed través de macropinocitosis, de los cuales aproximadamente el 70% de lo siRNA se exocytosed de las células dentro de las 24h de absorción^12,13. La mayoría de lo restantes siRNA es degradada a través de la vía lisosomal, y alcanzar en última instancia solamente 1-2% de lo siRNA que inicialmente entra en la célula con las nanopartículas escape endosomal a potencialmente ARNi^13,14 .

Recientemente hemos desarrollado nanopartículas de silicio poroso fusogénica (F-pSiNPs) que tienen un núcleo cargado de siRNA compuesta por nanopartículas de silicio poroso y fusogénicas lípidos concha¹⁵. F-pSiNPs presenta tres grandes ventajas sobre otros sistemas convencionales de oligonucleótidos: (1) un lípido fusogénicas capa que permite que las partículas de omitir la endocitosis y entregar la carga entera directamente en el citoplasma de la célula (en comparación con el 1-2% mediante la endocitosis partículas^13,14) (figura 1); (2) alta carga de masa siRNA en la pSiNPs (> 20% de peso en comparación con el 1-15% de peso por los sistemas convencionales)¹⁵, que rápidamente se degradan en el citoplasma (una vez que las partículas del núcleo arrojan la capa lipídica mediante absorción fusogénicas) para liberar el siRNA; y (3) orientación verbal de péptido homing selectivo a deseado tipos celulares in vivo.

El sistema F-pSiNP ha demostrado eficacia de silenciamiento del gen significativo (> 95% en vitro; > 80% in vivo) y posterior efecto terapéutico en un modelo de ratón fatal de la pulmonía de S. aureus ; los resultados de que se publicaron previamente¹⁵. Sin embargo, la compleja estructura del sistema F-pSiNP requiere manejo delicado y optimización optimizado para generar nanopartículas de uniforme y estables. Así, el propósito de este trabajo es presentar un protocolo exhaustivo, así como estrategias de optimización de la síntesis, funcionalización y caracterización de F-pSiNPs para ser utilizado en la entrega específica de siRNAs para efecto de silenciamiento del gene potente.

Protocolo

1. síntesis de nanopartículas de silicio poroso (pSINPs)

PRECAUCIÓN: Siempre tenga cuidado al trabajar con ácido fluorhídrico (HF). Siga a todas las guías de seguridad según su hoja de datos de seguridad (SDS), manejar productos químicos que contiene HF en una campana de humos y usar equipo de protección personal (PPE, guantes doble con guantes de butilo en el exterior, delantal de butilo con bata de laboratorio por debajo, cara proteger con gafas de seguridad debajo). Todas las universidades y laboratorios de investigación y desarrollo requieren una formación específica en seguridad de HF antes de uso. No intente trabajar con HF sin aprobación previa de su Coordinador de seguridad del laboratorio local, que son necesarias medidas de seguridad adicionales no descritas aquí.

1. Preparación de las soluciones de grabado
   1. Para hacer la solución del HF de 3:1 para grabado (utilizado en los pasos 1.3 y 1.4), llenar un plástico graduado con 30 mL de HF acuoso de 48% y 10 mL de etanol absoluto (EtOH). La solución debe estar contenida en los plásticos de alta densidad (por ejemplo, polietileno de alta densidad), como el HF disuelve el vidrio.
   2. Para hacer un 1:29 solución de HF para el despegue (utilizado en paso 1.5), llenar un plástico graduado cilindro con 1 mL de HF acuoso de 48% y 29 mL de etanol absoluto. La solución debe estar contenida en los plásticos de alta densidad (por ejemplo, polietileno de alta densidad), como el HF disuelve el vidrio.
   3. Que la solución KOH de 1 M en 10% EtOH para disolución de exceso pSi (usado en los pasos 1.3 y 1.5).
2. Configuración de la célula de etch
   1. En un Teflon grabado celular con 8,6 cm² grabe bien (área se calcula midiendo el diámetro de la superficie de silicio disponible para grabado dentro de la junta tórica y calcular el área por un = πr²), colocar en descendente (Figura 2a): (1) la Tapa de teflón celular; (2) una junta tórica; (3) un pedazo de cuarto de cristal único (1 0 0) - orientado p ++ - tipo oblea de silicio cortada en cuartos (usando un cortador de diamante); (4) papel de aluminio; y (5) la célula de teflón con tornillos la base suavemente apretadas para evitar fugas.
   2. Llenar el pozo con EtOH. Tomar un trapo e introducirla en la grieta entre la parte superior de la célula de Teflon y la base. Si el paño está secado al retirar, se sella la celda de etch. Si mojado, la célula se produce un derrame y apriete los tornillos más hasta sellar.
3. Electropulido la oblea de silicio
   1. Poner la célula etch montado en una campana de humos.
   2. Llenar el pozo con 10 mL de solución de HF de 3:1.
   3. Conecte el positivo del papel de aluminio (electrodo) de la célula de etch y conecte el cable negativo a la bobina de platino (el electrodo) sumergida en la solución de HF de 3:1 de la célula de etch para completar el circuito (figura 2b).
   4. Corren una constante corriente de 50 mA cm^-2 para 60 s. Grabado una vez haya terminado, saque el celular del circuito y enjuagar el HF de 3:1 con cuidado utilizando una jeringa. Enjuague con EtOH tres veces.
   5. A disolver la capa grabada llenando el pozo lentamente con 10 mL de 1 M de KOH. Espere hasta que el burbujeo disminuye.
   6. Enjuague el KOH con agua tres veces y luego con EtOH tres veces.
4. Electroquímicamente grabado capas porosas en la oblea de silicio
   1. Ejecutar una corriente alterna de onda cuadrada, con current density menor de 50 mA/cm² de 0,6 s y alta densidad de corriente de 400 mA/cm² para 0.36 s repetir para 500 ciclos.
   2. Grabado una vez haya terminado, saque el celular del circuito y enjuagar el HF de 3:1 con cuidado utilizando una jeringa. Enjuague con EtOH tres veces.
5. Elevación de la capa porosa de la oblea de silicio
   1. Llenar el pozo con 10 mL de 1:29 solución de HF.
   2. Ejecutar una constante de 3,7 mA/cm² para 250 s. Grabado una vez terminado, quite la célula del circuito. La capa de pSi puede tener ondulaciones visibles indicando la separación de la oblea de silicio cristalino. Suavemente Lave el 1:29 solución de HF y enjuague con EtOH tres veces, luego con agua tres veces.
   3. Utilizando una pipeta, firmemente romper el perímetro de la capa de pSi para la separación completa. Utilizando EtOH, recoge fragmentos pSi (chips) de la Teflon grabado celular en un barco pesado. Transferencia de las fichas a un frasco de vidrio. Las fichas de pSi pueden conservarse a temperatura ambiente en EtOH durante 6 meses para el almacenamiento.
   4. A disolver cualquier resto silicio poroso en la oblea llenando el pozo lentamente con 10 mL de 1 M de KOH. Espere hasta que el burbujeo disminuye.
   5. Enjuague el KOH con agua tres veces y luego con EtOH tres veces.
   6. Repita los pasos 1.3-1.5 hasta el espesor de la oblea entera ha sido grabado.
6. Sonicando capas porosas para la formación de nanopartículas
   1. Cambie el solvente del frasco de vidrio que contiene chips de pSi de EtOH a 2 mL de agua desionizada.
   2. Firmemente cierre la tapa y sello de parafilm.
   3. Lugar el vidrio del frasco en un baño sonicador y suspendido de tal forma que el volumen de virutas de pSi está sumergido totalmente debajo de la superficie.
   4. Someter a ultrasonidos para 12 h 35 kHz y la potencia de RF de 48W. Para evitar la pérdida de agua significativas durante la sonicación, colocar un matraz aforado llenado de agua, invertida de modo que la abertura del frasco toque la superficie de la bañera de agua.
   5. Coloque el frasco de cristal sobre una superficie plana durante 1 hora permitir que las partículas más grandes colocar en la parte inferior. Recoger el sobrenadante con una pipeta; la suspensión contiene pSiNPs de sub-100 nanómetro.

2. preparación de la película de lípidos fusogénicas

1. Preparación de las soluciones stock de lípidos
   1. En una campana de humos, hacer reservas de 10 mg/mL de lípidos hidratantes DMPC, DSPE-PEG-MAL y lípidos DOTAP en cloroformo. Estas soluciones pueden conservarse a-20 ° C hasta por 6 meses bajo sello apretado parafilm.
2. Hacer la película de lípidos fusogénicas
   Nota: La composición fusogénicas se hace de los lípidos, DMPC, DSPE-PEG y DOTAP, en la proporción molar de 76.2:3.8:20 y 96.2:3.8:0, respectivamente.
   1. En un frasco de vidrio, mezclar 72.55 μL de DMPC, 15.16 μL de DSPE-PEG y 19.63 μL de DOTAP mediante pipeteo.
   2. Opcional: Etiquetado fluorescente de la capa de lípidos, además Añadir 20 μl de DiI disuelto en EtOH en una concentración de 1 mg/mL.
   3. Coloque el vial en una campana de humos con una tapa suelta para permitir que el cloroformo se evapore durante la noche. La película seca será una nublado sustancia gelatinosa dura en la parte inferior del frasco.

3. carga y sellado de siRNA en pSiNPs

1. Preparación del carga stock el cloruro de calcio
   1. Disolver 1,11 g de CaCl₂ en 10 mL de agua libre de ARNasa para hacer una solución de 2 M CaCl₂ .
   2. Centrifugue la solución a > 10.000 x g durante 1 min colocar los agregados y recoger el sobrenadante con una pipeta. También puede filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm.
2. Preparación de lo siRNA carga stock
   1. Hidratar o diluir el siRNA a 150 μm en agua libre de ARNasa. Esta solución puede ser alícuotas y mantuvo congelado a-20 ° C durante al menos 30 días dado que no sufre frecuentes de congelación y descongelación.
3. Cargando el siRNA en pSiNPs con cloruro de calcio
   1. Preparar un baño de sonicación helado.
   2. A 15 de minutos de ultrasonidos, suavemente pipeta 150 μL de siRNA y 700 μl de 2 M de CaCl₂ en 150 μL de pSiNP. Asegúrese de que dejar abierta la tapa del tubo de microcentrífuga para la generación de gas.
   3. Retire el tubo que contiene 1 mL de pSiNPs de calcio cargados de siRNA revestido del sonicador.

4. capa pSiNPs cargado de siRNA con lípidos fusogénicas

1. Preparación del kit de extrusión de liposomas
   1. Llene un recipiente ancho con agua desionizada. Remojo policarbonato 1 membrana (poros de 200 nm) y 4 soportes de filtro flotando sobre la superficie del agua. Arme la liposoma extrusión siguiendo las instrucciones del fabricante
2. Hidratantes la película lipídica con siRNA-carga pSiNps
   1. Hidratar la película lipídica seca en el frasco de vidrio con 1 mL de pSiNPs cargado de siRNA calcio revestido de paso 3.3.3. Pipeta hasta que todas las películas de lípidos han levantado desde la parte inferior de la cubeta y se han mezclado en una solución homogénea nublada.
   2. Coloque una barra magnética de agitación en el frasco de cristal y colocar el frasco en un plato caliente para calentar las partículas a 40 ° C (o lo suficientemente alto por encima de la temperatura de transformación de fase de los lípidos para mantener los lípidos en la fase de cristal líquido más fluídica) mientras que magnéticamente remover la solución durante 20 minutos.
3. Sacar el pSiNPs recubiertos de lípidos para el control de tamaño
   1. Aspirar el 1 mL de solución de pSiNP-siRNA recubiertos de lípidos en la jeringa de extrusión. Inserte una jeringuilla vacía en un lado de la extrusora y la jeringa llena en el otro extremo.
   2. Comenzar la protuberancia presionando el émbolo lentamente para empujar las partículas de una jeringa, a través de la membrana de policarbonato y en el otro. Repetir 20 veces. Si el pistón está atascado, pueden estar tapados el filtro y la membrana. Desmontar la extrusora y vuelva a colocar los soportes de membrana y filtro. Si el problema persiste, diluir las partículas hasta que la obstrucción es manejable.
   3. Recoger las partículas extruidas en un tubo de microcentrífuga.

5. la conjugación de péptidos de focalización

1. Conjugando el targeting peptide a capa de lípidos
   1. Preparar el caldo del péptido con 1 mg/mL la concentración de péptido en agua libre de ARNasa.
   2. En el tubo de microcentrífuga con fusogénicas recubiertos de lípidos pSiNPs, añada 100 μl del stock de péptido 1 mg/mL y pipeta suavemente. Mantenga el tubo estático a temperatura ambiente durante 20 minutos (o bien, > 2 h a 4 ° C).
   3. Para quitar exceso péptido o siRNA y otros excipientes, lavar un filtro centrífugo de 30 kDa por girar a 5.000 x g a 25 ° C por 1 h. centrífuga dos veces más con 1 mL de PBS con la misma configuración.
   4. Resuspender el final fusogénicas conjugados péptido recubiertos de lípidos pSiNPs en PBS en la concentración deseada. Las partículas pueden alícuotas y congelados a-80 ° C para almacenamiento de al menos 30 días.

Resultados

Una síntesis exitosa de fusogénicas pSiNPs debe producir una solución homogénea, ligeramente opaca (figura 3a). Fracaso para optimizar la relación y la concentración de pSiNPs: siRNA: CaCl₂ puede conducir a la agregación a la carga (figura 3b). Como se sacan las partículas a través de 200 membranas nm, el diámetro medio de la hidrodinámico de la pSiNPs fusogénicas medido por DLS debe ser aproximadamente 200...

Discusión

Síntesis de nanopartículas de silicio poroso se muestran en la figura 5. El paso crítico en la síntesis de pSiNPs fusogénicas es en el paso de carga (paso 3). Si las nanopartículas fusogénicas están agregando la síntesis (figura 3), la razón puede deberse a lo siguiente: (1) stock de cloruro de calcio forma homogénea no estaba preparada, así paso 3.1.2 debe ser cuidadosamente seguido o refinado; o (2) la relación de pSiNP: siRNA: CaCl₂ o ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015