用于寡核苷酸传递的可生多孔硅纳米粒子的合成、功能化和表征

摘要

我们证明了富里多孔硅纳米粒子的合成, 以提高体外和体内寡核苷酸的传递效果。多孔硅纳米颗粒加入 siRNA 形成核心, 通过挤压包覆的杂原脂质形成外壳。包括定位功能化和粒子表征。

摘要

随着基因治疗的出现, 开发有效的体内核苷酸-有效载荷运载系统已成为平行的重要手段。具有较高的寡核苷酸承载能力和独特的细胞吸收途径, 避免了内吞, 其具有较高的体内基因沉默效率。F-pSiNPs 的合成是一个多步骤的过程, 包括: (1) 硅孔中寡核苷酸有效载荷的加载和密封;(2) 多孔硅芯周围的致热脂质同时涂装和施胶;(3) 结合靶向肽和洗涤, 去除多余的寡核苷酸、硅碎片和肽。粒子的尺寸均匀性以动态光散射为特征, 其核壳结构可通过透射电子显微镜验证。通过将亲脂性染料 1, 1 '-二辛代基-3, 3 ' 3 ', 3 '-四甲基硫代卡宾素高氯酸盐 (DiI) 加载到热原脂质双层 (DiI) 中, 并将其体外处理到细胞中, 观察质膜染色量与质膜的对比, 从而验证了热原吸收的有效性。内细胞定位。靶向和体内基因沉默的效果以前是在金黄色葡萄球菌肺炎的小鼠模型中量化的, 在该模型中, 靶向肽有望帮助 F-pSiNPs 回家到感染部位。除了在金黄色葡萄球菌感染中的应用外, F-pSiNP 系统还可用于提供任何寡核苷酸用于广泛疾病的基因治疗, 包括病毒感染、癌症和自身免疫性疾病。

引言

基因治疗调节特异性基因表达, 以获得治疗效果。已经发现并研究了许多基因调控工具, 包括使用寡核苷酸的核糖核酸干扰 (rnai) (例如, 短干扰 rna (sirna)^1,2, 微 rna (mirna)^3,4)、Dna 质粒^5、6、核酸酶 (如锌指、talens)^7、8和 crispr/cas9 系统^9,10。虽然每个工具的作用机制不同, 但所有工具都必须到达细胞的细胞质或细胞核才能活跃。因此, 虽然这些工具已被证明能诱导在体外调节基因表达方面发挥显著作用, 但体内的功效却存在细胞外和细胞内障碍。由于这些工具是生物来源的, 我们的身体中存在许多酶和清除系统, 有能力降解或去除外来分子¹¹。即使在工具到达目标细胞的情况下, 它们也会出现内吞;一种细胞吸收模式, 将工具封装和捕获在酸性胃状囊泡中, 使工具降解或排出细胞。事实上, 研究表明, 脂质纳米颗粒是通过共核细胞增多内植的, 大约70% 的 sirna 是在吸收的24小时内从细胞中排出^的,^{12, 13}。大部分剩余的 sirna 通过溶酶体途径降解, 最终只有1-2% 的 sirna 最初进入细胞, 而纳米颗粒实现内染色体逃逸, 有可能经历 rnai^13,14.

我们最近开发了具有由多孔硅纳米颗粒组成的 sirna 负载核心和一个熔融脂壳15的杂生多孔硅纳米颗粒 (F-pSiNPs).与其他常规寡核苷酸输送系统相比, F-sisnps 具有三大优势: (1) 一种能使颗粒绕过内吞并直接在细胞细胞质中提供整个有效载荷的致热脂质涂层 (与1-2% 相比)通过内细胞^{颗粒 13,14}) (图 1);(2) pSiNPs (& gt;20 wt% compared to 1-15 wt% by conventional systems)¹⁵, which rapidly degrade in the cytoplasm (once the core particles shed the lipid coating via fusogenic uptake) to release the siRNA; 中的 siRNA 的高质量负载(3) 靶向肽共轭, 选择性归巢于体内所需的细胞类型。

F-pSiNP 系统已证明了显著的基因沉默效能 (& gt;95% in vitro; & gt;80% in vivo) and subsequent therapeutic effect in a fatal mouse model of S. aureus pneumonia;其结果是在之前公布的15。然而, F-pSiNP 系统的复杂结构需要精细的处理和微调优化, 以产生均匀和稳定的纳米粒子。因此, 本工作的目的是提出一个完整的协议, 以及优化策略的合成, 功能化, 并表征 F-pSiNPs, 用于有针对性地传递 Sirna, 以实现强大的基因沉默效果。

研究方案

1. 多孔硅纳米粒子 (pSINPs) 的合成

注意: 使用氢氟酸 (HF) 时, 请务必小心。根据安全数据表 (SDS) 遵循所有安全指南, 在烟罩中处理任何含 hf 的化学品, 并佩戴适当的个人防护设备 (PPE; 外部有带丁基手套的双手套, 下面有实验室涂层的丁基围裙下面有安全护目镜)。所有大学和研发实验室在使用前都需要进行有关高频安全的专门培训。未经当地实验室安全协调员事先批准, 请勿尝试使用 HF, 因为此处未描述的其他安全措施是必需的。

1. 蚀刻解决方案的制备
   1. 要使 3:1 hf 溶液用于蚀刻 (用于步骤1.3 和 1.4), 请在塑料刻度缸中填充30毫升的水含量48% 的 Hf 和10毫升的绝对乙醇 (Etching)。该溶液必须包含在高密度塑料 (如高密度聚乙烯) 中, 因为 HF 溶解玻璃。
   2. 要制作 1:29 hf 溶液进行升空 (在步骤1.5 中使用), 请在塑料刻度缸中填充1毫升的水含量为 48% hf, 29 毫升为绝对乙醇。该溶液必须包含在高密度塑料 (如高密度聚乙烯) 中, 因为 HF 溶解玻璃。
   3. 在 10% EtOH 中制造 1 M KOH 溶液, 以获得多余的 pSi 溶解 (在步骤1.3 和1.5 中使用)。
2. 设置蚀刻单元格
   1. 在具有 8.6 cm²蚀刻井的特氟龙蚀刻电池中 (面积是通过测量可用于在 o 形圈内蚀刻的硅表面直径并按 a = r 2 计算面积来计算的), 按降序排列 (图 2a): (1)聚四氟乙烯细胞顶部;(2) o 形圈;(3) 四分之一片单晶 (1 0 0) 定向 p ++ 型硅片切割成四分之一 (使用金刚石切割机);(4) 铝箔;(5) 聚四氟乙烯电池底座用螺丝轻轻拧紧, 防止泄漏。
   2. 用 EtOH 填井。擦拭并插入特氟龙细胞顶部和底座之间的缝隙中。如果擦拭物在取出时干燥, 蚀刻细胞将被密封。如果湿了, 电池就会漏水, 并进一步拧紧螺丝, 直到密封。
3. 硅片电抛光
   1. 把组装好的蚀刻细胞放进通风罩里。
   2. 用 3:1 HF 溶液的10毫升填充油井。
   3. 将正引线从蚀刻电池连接到铝箔 (电极), 并将负极连接到浸入蚀刻电池的 31:1 HF 溶液中的铂线圈 (反电极), 以完成电路 (图 2b)。
   4. 在 50 mA cm-2 的情况下运行恒流, 为60秒。蚀刻完成后, 将电池从电路中取出, 然后使用注射器小心冲洗出 3:1 hf。用 EtOH 冲洗三次。
   5. 用 1 m KOH 的10毫升慢慢填充井, 溶解蚀刻层。等待, 直到冒泡消退。
   6. 用清水冲洗 KOH 三次, 然后用 EtOH 冲洗三次。
4. 电化学将多孔层蚀刻到硅片中
   1. 运行方形的交流电, 0.36 的较低电流密度为 50 macm² , 为0.6秒的高电流密度, 为0.36 秒重复500次循环。
   2. 蚀刻完成后, 将电池从电路中取出, 然后使用注射器小心冲洗出 3:1 hf。用 EtOH 冲洗三次。
5. 从硅片中提升多孔层
   1. 用 1:29 hf 溶液的10毫升填充油井。
   2. 运行一个 3.7 Ma/2 常数 250秒^.蚀刻完成后, 将电池从电路中取出。PSi 层可能有明显的波纹, 表明脱离晶体硅片。轻轻冲洗出 1:29 HF 溶液, 用 EtOH 冲洗三次, 然后用水三次。
   3. 使用移液器尖端, 牢固地破解 pSi 层的周长, 以实现完全分离。使用 Etch, 将聚四氟乙烯蚀刻细胞中的 pSi 碎片 (芯片) 收集到称重船中。把筹码转移到玻璃瓶上。PSi 芯片可在 EtOH 室温下保存6个月以上存放。
   4. 用 1 m KOH 的10毫升慢慢地填充井, 溶解晶片上剩余的多孔硅。等待, 直到冒泡消退。
   5. 用清水冲洗 KOH 三次, 然后用 EtOH 冲洗三次。
   6. 重复步骤 1.3-1.5, 直到整个晶圆厚度被蚀刻。
6. 用于纳米粒子形成的松孔层
   1. 将含有 psi 芯片的玻璃瓶的溶剂从 EtOH 更换为 2ml di 水。
   2. 牢固地关闭瓶盖, 并使用副管密封。
   3. 将玻璃瓶放入声纳浴缸中并悬挂, 使 pSi 芯片的体积完全淹没在表面以下。
   4. 在 35 kHz 的12小时和48W 的 RF 功率。为防止超声过程中出现严重的水分流失, 请放置一个充满水的体积瓶, 倒置, 使烧瓶的开口接触到水浴的表面。
   5. 将玻璃小瓶放在平坦的表面上 1小时, 以便较大的颗粒在底部沉淀。使用移液器收集上清液;悬浮液中含有小于 100 nm 的 pSiNPs。

2. 致热脂质膜的制备

1. 脂质脂片溶液的制备
   1. 在烟罩中, 通过在氯仿中对 DMPC、DSPE-PEG-MAL 和 DTAP 脂质进行补水, 制备 10 mgml 脂类。在密封紧密的情况下, 这些库存解决方案可在-20°c 下保存长达6个月。
2. 制作致热脂质膜
   注: 机身成分由脂质、DMPC、DSPE-PEG 和 DTAP 组成, 摩尔比分别为762:3.8:20 和96.2:3.8:0。
   1. 在玻璃小瓶中, 通过移液混合72.555μl 的 DMPC、15.16μl 的 DSPE-PEG 和19.63μl 的 DTAP。
   2. 可选: 对于脂质涂层的荧光标记, 另外加入20Μl 溶解在 EtOH 中的浓度为 1 mgml。
   3. 将小瓶放入烟帽中, 盖上宽松的瓶盖, 使氯仿在一夜之间蒸发。干燥的薄膜将是一个多云硬凝胶样物质在底部的小瓶。

3. pSiNPs 中 siRNA 的加载和密封

1. 氯化钙装载量的制备
   1. 在无 rna 水的10毫升中溶解 1.11 g 的 ccl₂ , 制成 2m ccl₂溶液。
   2. 以 10, 000 x克 > 离心溶液 1分钟, 以解决集料, 并使用移液器收集上清液。或者, 通过0.22μm 过滤器对溶液进行过滤。
2. SiRNA 加载量的制备
   1. 在无 RNAse-free 的水中将 siRNA 稀释或稀释至150μm。该库存溶液可单独报价, 并在-20°c 下冷冻至少 30天, 因为它不会经历频繁的冻融循环。
3. 用氯化钙加载 pSiNPs 中的 siRNA
   1. 准备一个冰的声纳浴。
   2. 在15分钟超声下, 轻轻移液150Μl 的 siRNA 和700μl 的 2M cicl₂到150Μl 的 pSiNP。确保将微离心管的盖子打开, 用于气体生成。
   3. 从声纳中取出含有1毫升 sirna 负载的钙涂层 pSiNPs 的管。

4. 用熔融脂质涂覆装有 sirna 的 pSiNPs

1. 脂质体挤出试剂盒的研制
   1. 用 DI 水填充宽烧杯。浸泡1个聚碳酸酯膜 (200 纳米毛孔) 和4个过滤器通过漂浮在水面上来支撑。按照制造商的说明组装脂质体挤出套件
2. 用 srna 负载 pSiNps 保湿脂质膜
   1. 用步骤3.3.3 得到的1毫升的 sirna 钙涂层 pSiNPs 对玻璃瓶中的干脂质膜进行水合作用。移液器, 直到所有的脂膜已从小瓶底部解除, 并混合成一个多云的均匀溶液。
   2. 将磁性搅拌棒放在玻璃瓶中, 然后将小瓶放在热板上, 将颗粒加热至 40°c (或高于脂质相变温度, 以保持流动性较高的液晶相中的脂质), 同时磁性地保持脂质的流动态晶体相)搅拌溶液20分钟。
3. 挤出用于尺寸控制的脂涂层 pSiNPs
   1. 在挤出注射器中吸入1毫升的脂质包覆 pSiNP-siRNA 溶液。在挤出机的一侧插入一个空注射器, 在另一端插入填充的注射器。
   2. 开始挤压, 将活塞缓慢地推入, 将颗粒从一个注射器中推入聚碳酸酯膜, 然后进入另一个注射器。重复20次。如果活塞卡住, 过滤器和膜可能会堵塞。拆卸挤出机, 更换膜和过滤器支架。如果问题仍然存在, 请稀释颗粒, 直到堵塞是可控的。
   3. 将挤出的颗粒收集到微离心管中。

5. 靶向肽的结合

1. 结合靶向肽与脂质涂层
   1. 在无 rnac 水中制备含有 1 mgml 肽浓度的肽库存。
   2. 在含有自熔性脂质涂层 pSiNPs 的微离心管中, 加入100μl 的 1 mgml 肽片, 轻轻加入管。在室温下保持管的静态 20分钟 (或者, 在4°C 下保持 > 2小时)。
   3. 为了去除多余的肽或 siRNA 和其他辅料, 在 30 kDa 离心过滤器中清洗, 在25°c 下以 5, 000 x g的温度旋转 1小时. 在相同的设置下, 用 1 ml 的 pbs 再离心两次。
   4. 在 PBS 中, 以所需的浓度重新使用最后的消化共轭熔融脂肪包覆 Psnps。这些粒子现在可以在-80°c 下进行估计和冷冻, 以便储存至少30天。

结果

成功合成杂生 pSiNPs 应能产生均匀、略显不透明的溶液 (图 3a)。如果不能优化 pSiNPs 的比例和浓度: Sirn:ccol₂可能会导致加载时聚集 (图 3b)。当颗粒通过200纳米膜挤出时, DLS 测量的致熔剂 pSiNPs 的平均流体动力直径应为约200纳米, 平均 zeta 电位约为 + 7 mV, 如图 4所示。在靶向肽表面改性后, 总直径应增?...

讨论

多孔硅纳米粒子的合成如图 5所示。在合成杂源 pSiNPs 的关键步骤是在加载步骤 (步骤 3)。如果机身纳米颗粒聚集后合成 (图 3), 原因可能是: (1) 氯化钙库存不是均匀制备的, 因此步骤3.1.2 必须仔细跟踪或细化;或 (2) Psin:sirn:cicl 2 的比率或三个成分中的一个或多个成分的浓度可能不是最佳的。建议从 Ccl 2 浓度开始重新优化 (例如, 从2m 更改?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015