Sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna del Oligonucleotide

Riepilogo

Dimostriamo la sintesi di nanoparticelle di silicio poroso fusogena per la consegna effettiva del oligonucleotide in vitro e in vivo. Silicio poroso nanoparticelle vengono caricate con siRNA per formare il nucleo, che è rivestito dai lipidi fusogena attraverso estrusione per formare il guscio. I servizi e le dotazioni comprendono targeting frazione funzionalizzazione e caratterizzazione delle particelle.

Abstract

Con l'avvento della terapia genica, lo sviluppo di un sistema di consegna efficaci in vivo del nucleotide-payload è diventata di importazione parallela. Fusogena silicio poroso nanoparticelle (F-pSiNPs) hanno recentemente dimostrato alto genico in vivo di efficacia a causa sua oligonucleotide ad alto capacità di carico e via di assorbimento cellulare unico che evita endocitosi. La sintesi di F-pSiNPs è un processo a più fasi che include: (1) di carico e la sigillatura di payload del oligonucleotide nei pori di silicio; (2) rivestimento simultanea e dimensionamento dei lipidi fusogena intorno i nuclei di silicio poroso; e (3) coniugazione di peptidi di targeting e lavaggio per rimuovere l'eccesso del oligonucleotide, detriti di silicio e il peptide. Uniformità di dimensione della particella è caratterizzata da diffusione dinamica della luce, e la sua struttura core-shell può essere verificata da microscopia elettronica di trasmissione. L'assorbimento di fusogena viene convalidato caricando un lipofilico tingere, 1, 1'-Diottadecilbis-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), in bilayer del lipido fusogena e trattandolo alle cellule in vitro per osservare per membrana plasmatica colorazione contro localizzazioni endocitosi. I efficacies di silenziamento gene targeting e in vivo in precedenza sono stati quantificati in un modello murino di polmonite Staphylococcus aureus , in cui è previsto il peptide targeting per aiutare il F-pSiNPs a casa per il sito di infezione. Oltre la sua applicazione nell'infezione di S. aureus , il sistema di F-pSiNP può essere usato per fornire qualsiasi oligonucleotide per la terapia genica di una vasta gamma di malattie, compreso le infezioni virali, cancro e malattie autoimmuni.

Introduzione

Terapia genica modula l'espressione genica specifici per ottenere un risultato terapeutico. Numerosi strumenti per la modulazione del gene sono stati scoperti e studiati, compreso acido ribonucleico interferenza (RNAi) utilizzando oligonucleotidi (ad es., breve interfering RNA (siRNA)^1,2, microRNA (miRNA)^3,4 ), DNA plasmidi^5,6, nucleasi (ad es., dito di zinco, TALENS)^7,8e CRISPR/Cas9 sistemi^9,10. Mentre il meccanismo di ciascuno strumento di azione è diverso, tutti gli strumenti deve raggiungere il citoplasma della cellula o il nucleo è attivo. Come tale, mentre questi strumenti hanno dimostrato di indurre un effetto significativo nella modulazione della espressione genica in vitro, in vivo l'efficacia soffre da ostacoli extracellulari ed intracellulari. Dovuto al fatto che gli strumenti sono di origine biologica, molti enzimi e sistemi di sdoganamento esistano nel nostro corpo che hanno la capacità di degradare o rimuovere le molecole estranee¹¹. Anche nel caso che gli strumenti di raggiungano la cella obiettivo, essi soffrono di endocitosi; una modalità di assorbimento cellulare che incapsula e intrappola gli strumenti in acido dello stomaco-come vescicole che degradano o espellere gli strumenti fuori dalla cella. Infatti, studi hanno dimostrato che nanoparticelle lipidiche sono stimolazione tramite Macropinocitosi, da cui circa il 70% dei siRNA sono exocytosed dalle cellule all'interno di 24h di assorbimento^12,13. La maggior parte del siRNA rimanente vengono degradata attraverso il pathway lisosomiale, e in definitiva soltanto 1-2% di siRNA che inizialmente entra nella cellula con le nanoparticelle ottenere fuga endosomal potenzialmente subire RNAi^13,14 .

Recentemente abbiamo sviluppato le nanoparticelle di silicio poroso fusogena (F-pSiNPs) che hanno un nucleo caricato siRNA composto di silicio poroso nanoparticelle e un fusogena lipidica shell¹⁵. F-pSiNPs presentano tre vantaggi principali rispetto ad altri sistemi di consegna del oligonucleotide convenzionale: (1) un lipide fusogena rivestimento che permette alle particelle di bypassare endocitosi e consegnare l'intero payload direttamente nel citoplasma delle cellule (contro l'1-2% raggiunto da stimolazione particelle^13,14) (Figura 1); (2) carico di massa elevata di siRNA nella pSiNPs (> 20% in peso rispetto al 1-15 wt % dai sistemi convenzionali)¹⁵, che degradano rapidamente nel citoplasma (una volta che le particelle del nucleo capannone il rivestimento lipidico tramite l'assorbimento fusogena) per rilasciare il siRNA; e (3) targeting coniugazione del peptide per homing selettiva al desiderato tipi di cellule in vivo.

Il sistema F-pSiNP ha dimostrato notevole efficacia il silenziamento genico (> 95% in vitro; > 80% in vivo) e conseguente effetto terapeutico in un modello murino mortale di polmonite Staphylococcus aureus ; i risultati di cui sono stati pubblicati in precedenza¹⁵. Tuttavia, la complessa struttura del sistema F-pSiNP richiede manipolazioni delicate e ottimizzazione fine-tuned per generare nanoparticelle uniforme e stabile. Così, lo scopo di questo lavoro è di presentare un protocollo approfondito, nonché strategie di ottimizzazione per la sintesi, funzionalizzazione e caratterizzazione di F-pSiNPs per essere utilizzato in somministrazione mirata di siRNA per effetto di silenziamento del gene potente.

Protocollo

1. sintesi di nanoparticelle di silicio poroso (pSINPs)

Attenzione: Usare sempre cautela quando si lavora con acido fluoridrico (HF). Seguire tutte le guide di sicurezza secondo la sua scheda di dati di sicurezza (SDS), maneggiare sostanze chimiche contenenti HF in una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi di protezione personale (PPE; doppie guanti con guanti di butyl all'esterno, grembiule di butile con camice sotto, viso scudo con occhiali di sicurezza sotto). Tutte le università e i laboratori R & D richiedono una formazione specifica sulla sicurezza HF prima dell'uso. Non tentare di lavorare con HF senza pre-approvazione del Coordinatore sicurezza laboratorio locale, come sono necessarie misure di sicurezza aggiuntive non descritte qui.

1. Preparazione delle soluzioni acquaforte
   1. Per rendere la soluzione di HF di 3:1 per acquaforte (utilizzato nei punti 1.3 e 1.4), riempire una plastica laureato cilindro con 30 mL di acquosa 48% HF e 10 mL di etanolo assoluto (EtOH). La soluzione deve essere contenuta in materiale plastico ad alta densità (ad es., HDPE), come la HF scioglie il vetro.
   2. Per rendere un 01:29 soluzione di HF per decollo (usato nel passaggio 1.5), riempimento a plastica laureato cilindro con 1 mL di acquosa 48% HF e 29 mL di etanolo assoluto. La soluzione deve essere contenuta in materiale plastico ad alta densità (ad es., HDPE), come la HF scioglie il vetro.
   3. Rendono la soluzione KOH 1 M in 10% EtOH per dissoluzione del pSi in eccesso (utilizzato in passaggi 1.3 e 1.5).
2. Impostare la cella di etch
   1. In Teflon etch cella con una 8,6 cm² etch bene (zona viene calcolato misurando il diametro della superficie del silicio disponibile per incisione all'interno l'o-ring e calcolare l'area di A = πr²), posto in senso decrescente (Figura 2a): (1) il Parte superiore della cella Teflon; (2) un o-ring; (3) un pezzo di quarto del cristallo singolo (1 0 0) - orientato p + + - wafer di silicio del tipo tagliati in quarti (utilizzando una fresa di diamante); (4) foglio di alluminio; e (5) la cella di Teflon base con viti serrate delicatamente per evitare perdite.
   2. Riempire il pozzetto con EtOH. Prendere un wipe e inserire nella fessura tra la parte superiore della cella in Teflon e la base. Se la cancellazione è asciutta dopo l'estrazione, la cella di etch è sigillata. Se bagnato, la cella sta perdendo e stringere le viti più ulteriormente fino a quando non sigillato.
3. Elettrolucidatura il wafer di silicio
   1. Portare la cella di etch montato in una cappa aspirante.
   2. Riempire il pozzetto con 10 mL di soluzione di HF di 3:1.
   3. Collegare il cavo positivo per il foglio di alluminio (elettrodo) dalla cella etch e collegare il polo negativo della bobina platino (contro-elettrodo) immersi nella soluzione di HF di 3:1 della cella etch per completare il circuito (Figura 2b).
   4. Eseguire una corrente costante a 50 mA cm^-2 per 60 s. Una volta etch è finito, rimuovere la cella dal circuito e risciacquare l'HF di 3:1 con attenzione usando una siringa. Risciacquare con EtOH tre volte.
   5. Sciogliere via lo strato inciso compilando il pozzo lentamente con 10 mL di 1 M di KOH. Attendere che le bolle si abbassa.
   6. Risciacquare il KOH con acqua tre volte e poi con EtOH tre volte.
4. Elettrochimicamente acquaforte strati porosi in wafer di silicio
   1. Eseguire una corrente alternata di una forma d'onda quadra, con current density inferiore di 50 mA/cm² per 0,6 s e alta densità di corrente di 400 mA/cm² per 0.36 s ripetuto per 500 cicli.
   2. Una volta etch è finito, rimuovere la cella dal circuito e risciacquare l'HF di 3:1 con attenzione usando una siringa. Risciacquare con EtOH tre volte.
5. Sollevamento-off lo strato poroso da wafer di silicio
   1. Riempire il pozzetto con 10 mL di 01:29 soluzione di HF.
   2. Eseguire una costante di 3,7 mA/cm² per 250 s. Una volta etch è finito, rimuovere la cella dal circuito. Lo strato di pSi potrebbe essere visibile ondulazioni che indica distacco dai wafer di silicio cristallino. Delicatamente lavare fuori il 01:29 soluzione di HF e risciacquare con EtOH tre volte, poi con acqua tre volte.
   3. Utilizzando un puntale, crepa saldamente la circonferenza dello strato pSi per separazione completa. Utilizzando EtOH, raccogliere i frammenti di pSi (chip) dal Teflon etch cella in una barca di pesatura. Trasferire il chip di un flaconcino di vetro. I chip di pSi possono essere tenuti a temperatura ambiente in EtOH per oltre 6 mesi per l'archiviazione.
   4. Sciogliere via qualsiasi residuo silicio poroso sul wafer compilando il pozzo lentamente con 10 mL di 1 M di KOH. Attendere che le bolle si abbassa.
   5. Risciacquare il KOH con acqua tre volte e poi con EtOH tre volte.
   6. Ripetere i passaggi 1.3-1.5 per lo spessore del wafer intero è stato inciso.
6. Sonicating strati porosi per la formazione di nanoparticelle
   1. Sostituire il solvente del flaconcino di vetro contenente pSi chip da EtOH a 2 mL di acqua deionizzata.
   2. Saldamente chiudere il tappo e guarnizione con parafilm.
   3. Posto il vetro fiala in un bagno sonicatore e sospeso tale che il volume di pSi chip completamente sommerso sotto la superficie.
   4. Sonicare per 12 h a 35 kHz e potenza RF di 48W. Per evitare perdite d'acqua significative durante la sonicazione, posizionare un matraccio riempito d'acqua, invertito in modo che l'apertura del pallone tocca la superficie del bagno d'acqua.
   5. Collocare il flaconcino di vetro su una superficie piana per 1 h per consentire le particelle più grandi di stabilirsi nella parte inferiore. Raccogliere il surnatante con una pipetta; la sospensione contiene pSiNPs di sotto dei 100 nm.

2. preparazione del film lipidico fusogena

1. Preparazione delle soluzioni stock del lipido
   1. In una cappa, fanno scorte di 10 mg/mL di lipidi da idratante DMPC, DSPE-PEG-MAL e DOTAP lipidi in cloroformio. Queste soluzioni di riserva possono essere conservate a-20 ° C fino a 6 mesi sotto stretto parafilm sigillo.
2. Rendendo il film lipidico fusogena
   Nota: La composizione fusogena è costituita i lipidi, DMPC, DSPE-PEG e DOTAP, al rapporto molare di 76.2:3.8:20 e 96.2:3.8:0, rispettivamente.
   1. In un flaconcino di vetro, mescolare 72.55 μL di DMPC, 15.16 μL di DSPE-PEG e 19.63 μL di DOTAP pipettando.
   2. Facoltativo: Per l'etichettatura fluorescente del rivestimento lipidico, inoltre aggiungere 20 µ l di DiI disciolto in EtOH ad una concentrazione di 1 mg/mL.
   3. Collocare il flaconcino in una cappa con un tappo allentato per permettere il cloroformio di evaporare durante la notte. Il film essiccato sarà una sostanza gelatinosa dura nuvolosa in fondo del flaconcino.

3. caricamento e la sigillatura di siRNA in pSiNPs

1. Preparazione del cloruro di calcio caricamento di supporti
   1. Sciogliere 1,11 g di CaCl₂ in 10 mL di acqua RNAsi-libera per fare una soluzione di₂ CaCl 2 M.
   2. Centrifughi la soluzione a > 10.000 x g per 1 min di stabilirsi degli aggregati e raccogliere il surnatante con una pipetta. In alternativa, è possibile filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm.
2. Preparazione di siRNA caricamento di supporti
   1. Idratare o diluire il siRNA a 150 µM in acqua RNAsi-libera. Questa soluzione può essere aliquotata e conservati congelata a-20 ° C per almeno 30 giorni dato che non subisce frequenti di congelamento-scongelamento.
3. Caricamento del siRNA in pSiNPs con cloruro di calcio
   1. Preparare un bagno ghiacciato sonicazione.
   2. A meno di 15 min sonicazione, delicatamente dispensare 150 µ l di siRNA e 700 µ l di 2m CaCl₂ in 150 µ l di pSiNP. Assicurarsi di lasciare aperto il coperchio del tubo del microcentrifuge per la generazione di gas.
   3. Togliere la provetta contenente 1 mL di pSiNPs di calcio siRNA-caricato rivestito da sonicatore.

4. rivestimento pSiNPs siRNA-caricato con i lipidi fusogena

1. Preparazione del kit estrusione liposoma
   1. Riempire un bicchiere largo con dell'acqua distillata. Membrana di ammollo 1 policarbonato (200 nm pori) e 4 supporti filtro facendo loro galleggiare sulla superficie dell'acqua. Montare il kit di estrusione liposoma seguendo le istruzioni del produttore
2. Idratante il film lipidico con siRNA-caricato pSiNps
   1. Idratare il film lipidico secchi in flaconcino di vetro con 1 mL di siRNA-caricato calcio rivestito pSiNPs ottenuti dal punto 3.3.3. Pipettare fino a quando tutti i film di lipidi hanno sollevato dal fondo del flaconcino e sono mescolati in una soluzione omogenea nuvolosa.
   2. Inserire una barra di agitazione magnetica in flaconcino di vetro e inserire il flaconcino su una piastra calda per riscaldare le particelle a 40 ° C (o abbastanza in alto sopra la temperatura di trasformazione di fase dei lipidi per mantenere i lipidi nella fase di cristalli liquidi più fluidica) mentre magneticamente mescolando la soluzione per 20 min.
3. Il pSiNPs del lipido-rivestito per controllo di dimensione di estrusione
   1. Aspirare il 1 mL di soluzione di lipido-rivestito pSiNP-siRNA nella siringa estrusione. Inserire una siringa vuota su un lato dell'estrusore e la siringa riempita a altra estremità.
   2. Estrusione di Begin spingendo il pistone lentamente a spingere le particelle da una siringa, attraverso la membrana di policarbonato e in altra. Ripetere 20 volte. Se il pistone è bloccato, il filtro e la membrana potrebbe essere ostruiti. L'estrusore di smontare e sostituire la membrana e filtro supporta. Se il problema persiste, è necessario diluire le particelle fino a intasamento è gestibile.
   3. Raccogliere le particelle estruse in una microcentrifuga.

5. coniugazione di targeting peptidi

1. Coniugazione del peptide targeting al rivestimento lipidico
   1. Preparare il brodo di peptide con un 1mg/mL concentrazione nel peptide in acqua RNAsi-libera.
   2. Nel tubo del microcentrifuge contenente fusogena lipido-rivestito pSiNPs, aggiungere 100 µ l del 1 mg/mL di brodo di peptide e pipettare delicatamente. Tenere il tubo statica a temperatura ambiente per 20 minuti (in alternativa, > 2 h a 4 ° C).
   3. Per rimuovere l'eccesso peptide o siRNA e altri eccipienti, lavare in un filtro centrifugo di 30 kDa di filatura a 5.000 x g a 25 ° C per 1 h. centrifuga altre due volte con 1 mL di PBS sotto la stessa impostazione.
   4. Risospendere il finale fusogena coniugati peptide del lipido-rivestito pSiNPs in PBS alla concentrazione desiderata. Le particelle possono ora essere aliquotati e congelati a-80 ° C per la conservazione di almeno 30 giorni.

Risultati

Una riuscita sintesi di fusogena pSiNPs dovrebbe produrre una soluzione omogenea, leggermente opaca (Figura 3a). Il mancato rispetto di ottimizzare il rapporto e la concentrazione di pSiNPs: siRNA: CaCl₂ può condurre all'aggregazione al caricamento (Figura 3b). Come le particelle vengono estruse attraverso membrane di 200 nm, il diametro medio di idrodinamico della pSiNPs fusogena misurata da liste di distribuzione de...

Discussione

Sintesi di nanoparticelle di silicio poroso sono illustrato nella Figura 5. Il passaggio fondamentale nella sintesi di fusogena pSiNPs è in fase di caricamento (passaggio 3). Se le nanoparticelle fusogena aggregano post-sintesi (Figura 3), il motivo potrebbe essere a causa di quanto segue: (1) stock di cloruro di calcio non era preparato omogeneamente, così passo 3.1.2 dovrà essere attentamente seguito o raffinato; o (2) il rapporto di pSiNP: siRNA: CaCl_...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015