合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

要約

効果的な in vitro および in vivo のオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を示します。ポーラス シリコンのナノ粒子は、シェルを形成する押し出しによる融合ペプチド脂質によるコーティングの核を形成する siRNA によって読み込まれます。ターゲット部位の機能化と粒子特性含まれます。

要約

遺伝子療法の出現により、効果的な体内ヌクレオチド ペイロード搬送システムの開発は並行輸入となっています。融合性ポーラス シリコンのナノ粒子 (F pSiNPs) 高 in vivo 遺伝子サイレンシング力およびエンドサイトーシスを回避するユニークな細胞内取り込み経路その高オリゴヌクレオチドによる有効性を示してきた。F pSiNPs の合成は複数の手順が含まれている: (1) 読み込みとシリコン毛穴; へのオリゴヌクレオチド ペイロードのシール(2) 同時コーティング ・融合ペプチド脂質ポーラス シリコンのコアの周りのサイジング(3) の共役ペプチドをターゲット ・洗浄の余分なオリゴヌクレオチド、シリコンの破片、およびペプチドを削除します。粒子の大きさの均一性は動的光散乱によって特徴付けられるし、そのコア ・ シェル構造は、電子顕微鏡による検証可能性があります。膜融合吸収は、脂溶性の読み込みによって検証された染料、1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 融合ペプチドの脂質二重膜に、細胞膜と染色の観察する治療エンドサイトーシスのローカライズ。ターゲットおよび in vivo 遺伝子サイレンシング効果はターゲットのペプチドの F pSiNPs は、感染部位に家が予想される黄色ブドウ球菌肺炎マウスモデルにおける定量化された以前。黄色ブドウ球菌感染症における応用を越えて F pSiNP システムは幅広い領域の疾患、ウイルス感染症、がん、自己免疫疾患などの遺伝子治療の任意のオリゴヌクレオチドを提供する使用ことがあります。

概要

遺伝子治療は、治療の結果を取得する特定の遺伝子発現を調節します。遺伝子の調節のための多数のツールを検出し、(例えば、短い干渉 RNA (siRNA)^1、2、マイクロ Rna (miRNA)^{3,4 のオリゴヌクレオチドを使用してリボ核酸干渉 (RNAi) などを学び、})、DNA プラスミド^5,6核酸 (例えば、亜鉛指、TALENS)^7、8、および CRISPR/Cas9 システム^9,10。各ツールの作用機序とは異なる中、セルの細胞質またはアクティブ化する核に到達する必要がありますすべてのツール。など、これらのツールは、体外遺伝子発現を調節することで有意な効果を誘導するために証明されている、間に生体内での有効性は細胞外と細胞内の障害物によって苦しみます。ツールは、生物学的起源、という事実のために多くの酵素やクリアランス システムが低下または外国の分子¹¹を削除する能力を持っている私たちの体で存在します。場合でも、彼らはエンドサイトーシス; から苦しむ目的セルをツールに到達トラップの低下またはセルからツールを追放する酸性の胃のような小胞に含まれるツールをカプセル化して細胞内取り込みモード。実際には、研究はマクロピノサイトーシス、元、siRNA の約 70% が吸収^12,13の 24 h 内のセルから exocytosed 経由で貪食を脂質ナノ粒子には示しています。残りの siRNA の大半はリソソーム経路によって劣化が、最終的に当初がナノ粒子でセルに入る siRNA の唯一の 1-2% 達成潜在的 RNAi^{13,14 を受けるエンドソーム脱出}.

最近融合ペプチド脂質シェル¹⁵とポーラス シリコン微粒子から成る siRNA ロードのコアを持つ融合性ポーラス シリコン ナノ粒子 (F pSiNPs) を開発しました。F pSiNPs 提示他従来オリゴヌクレオチド配信システムの 3 つの主要な利点: (1) エンドサイトーシスをバイパスし、ペイロード全体を (1-2% 対細胞細胞質内に直接配信する粒子ができますコーティング膜融合脂質貪食粒子^13,14目標達成) (図 1)。pSiNPs の siRNA の (2) の高質量負荷 (> 1-15 wt % により、従来に比べて 20 wt %)¹⁵、急速に低下する細胞質 (一度コア粒子は膜融合吸収を介して脂質コーティングを流す); siRNA を解放するには(3) と体内細胞の種類を希望する選択的ホーミングのペプチド共役をターゲットします。

F pSiNP システムは、重要な遺伝子サイレンシング効果を実証してきました (> 95% 生体外で; > 体内の 80%)、黄色ブドウ球菌肺炎の致命的なマウスモデルでの後の治療効果結果¹⁵以前公開されました。ただし、繊細な取り扱いと均一で安定したナノ粒子を生成するために微調整の最適化、F pSiNP システムの複雑な構造が必要です。したがって、この作業の目的は徹底的なプロトコルとして合成、機能化、および強力な遺伝子サイレンシング効果に Sirna のターゲットを絞った配信で使用する F pSiNPs の特性の最適化戦略を提示します。

プロトコル

1. ポーラス シリコンのナノ粒子 (pSINPs) の合成

注意: は、フッ化水素酸 (HF) を使用するときに常に注意を使用します。その安全データシート (SDS) によるとすべての安全ガイドに従ってください、発煙のフードで HF を含む化学薬品を処理し、適切な個人用保護具 (PPE; 外にブチル手袋をして二重手袋、ブチル、顔の下に白衣とエプロンを着用シールドの下に安全ゴーグル)。すべての大学と研究室を使用する前に HF 安全性に関する具体的なトレーニングが必要です。ここに記述されていない追加の安全対策が必要なため、地元の研究室安全担当の事前承認せず HF で作業をしないでください。

1. エッチング溶液の調製
   1. プラスチックを埋めるエッチング (手順 1.3 と 1.4 で使用)、3:1 心不全のソリューションにするため水溶液 48 %hf の 30 mL と 10 mL の無水エタノール (エタノール) のシリンダーを卒業しました。ソリューションは、HF はガラスを溶解する、高密度プラスチック (例えば、HDPE) に含まれなければなりません。
   2. 1:29 にリフトオフ (で使用される手順 1.5)、プラスチック、塗りつぶし用 HF ソリューションは 1 ml の水溶液の 48 %hf と無水エタノール 29 mL シリンダーを卒業しました。ソリューションは、HF はガラスを溶解する、高密度プラスチック (例えば、HDPE) に含まれなければなりません。
   3. 10% で 1 M KOH 溶液を作る余分な pSi 解散 (手順 1.3 と 1.5 で使用) のエタノール。
2. Etch のセルを設定します。
   1. テフロンで etch 8.6 cm セル²エッチも (o リング内エッチングおよび A によって面積を計算するのに使用できるシリコン表面の直径を測定することにより面積を計算 = πr²)、降順 (図 2 a) に: (1)、テフロン セルの上端。(2) o;(3) 単結晶の四分の一部分 (1 0 0) - 指向 p + + - 型シリコンウェーハ (ダイヤモンド カッターを使用して) の四分の一にカット(4) アルミ箔。(5) とネジで基本テフロン セル優しく漏れを防ぐためにきつく締められます。
   2. エタノールで井戸を埋めます。ワイプを取る、テフロン セルの上部と下部の隙間に差し込みます。ワイプは、除去時に乾燥が、etch セルは密封されます。ウェット、セルが漏れていると締めシールまで、ネジはさらに。
3. 電解研磨、シリコンウエハー
   1. ヒューム フードに組み立てられたエッチング細胞をもたらします。
   2. 3:1 HF 溶液 10 mL で井戸を埋めます。
   3. エッチ携帯からアルミ箔 (電極) に肯定的な鉛と回路 (図 2 b) を完成するエッチング セルの 3:1 HF 溶液中浸漬プラチナ コイル (カウンター電極) に負のリード線を接続します。
   4. 実行定電流 50 mA cm^-2 60 s。一度のエッチングが完了したら、回路からセルを削除し、慎重に注射器を使用して 3:1 HF を洗います。エタノールで 3 回を洗い流してください。
   5. 井戸を埋めることでエッチング加工層を離れて溶解 10 mL 1 M 島でゆっくりと。バブルがおさまるまで待ちます。
   6. 水 3 回とし、エタノール 3 回島を洗います。
4. シリコンウェーハに多孔質層を電気化学的エッチング
   1. 50 mA/cm² 0.6 s の低い current density と 0.36 の 400 mA/cm²の電流密度で方形波の交流電流を実行 s が 500 サイクルで繰り返されます。
   2. 一度のエッチングが完了したら、回路からセルを削除し、慎重に注射器を使用して 3:1 HF を洗います。エタノールで 3 回を洗い流してください。
5. シリコンウエハーから多孔質の層を持ち上げる
   1. 1:29 の 10 mL で井戸を埋める HF ソリューション。
   2. 3.7 mA/cm² 250 のための定数を実行 s。一度エッチングが完了したら、回路からセルを削除します。PSi 層は、結晶シリコン基板からの剥離を示す表示される波紋があります。優しく洗って、1:29 HF ソリューションと江藤 3 倍を水 3 回をすすいでください。
   3. 完全剥離の pSi の層のまわりの亀裂ピペット チップを使用して、しっかりと。計量ボートにセルを etch テフロンから pSi 片 (チップ) エタノールを使用すると、収集。ガラスの瓶にチップを転送します。PSi チップ保管貯蔵のため 6 ヶ月以上で江藤に室温で。
   4. 井戸を埋めることでウェーハ上残り多孔質シリコンを離れて溶解 10 mL 1 M 島でゆっくりと。バブルがおさまるまで待ちます。
   5. 水 3 回とし、エタノール 3 回島を洗います。
   6. 1.3 から 1.5 の手順を繰り返して全体の厚みが刻み込まれています。
6. ナノ粒子形成 sonicating 多孔質層
   1. 純水 2 mL にエタノールから pSi チップを含むバイアルの溶媒を交換してください。
   2. しっかりとキャップをしめて、パラフィルムを使用して密封します。
   3. ガラス超音波発生装置バースのバイアルし、pSi チップの量は表面の下に水没するように中断された場所です。
   4. 35 kHz と 48 w フィットの高周波電力で 12 h の超音波照射します。超音波処理中に重要な水損失を防ぐため、あふれた水にフラスコのオープニング風呂の水の表面に触れるように反転メスフラスコを配置します。
   5. 下部に解決するより大きい粒子を許可するように 1 h の平らな面にガラスの瓶を置きます。ピペット; を使用して上澄みを集めサスペンションには、サブ 100 nm pSiNPs が含まれています。

2. 融合ペプチド脂質膜の作製

1. 脂質の貯蔵液の準備
   1. 発煙のフード DMPC, DSPE ペグ MAL およびクロロホルム DOTAP 脂質を潤いで脂質の 10 mg/mL 株を作る。これらの原液を-20 ° C で保管して、タイトなパラフィルム シールの下まで 6 ヶ月間よい。
2. 融合ペプチド脂質膜を作る
   注: 融合ペプチド組成で脂質、DMPC、DSPE ・ ペッグ、DOTAP、76.2:3.8:20、96.2:3.8:0、モル比でそれぞれされます。
   1. ガラス瓶でピペッティングによる 19.63 μ DOTAP、DSPE ・ ペッグの 15.16 μ L DMPC 72.55 μ L をミックスします。
   2. オプション: 蛍光脂質コーティングの分類、また追加 DiI の 20 μ L が 1 mg/mL の濃度でエタノールに溶解します。
   3. 一晩蒸発にクロロホルムを許可するように緩んでキャップとヒューム フードにバイアルを配置します。乾燥皮膜は、バイアルの下部曇りハード ゲル状物質になります。

3. 読み込みと pSiNPs の siRNA のシール

1. 在庫の読み込みカルシウム塩化物の準備
   1. CaCl の 1.11 g を溶かす₂ 2 M CaCl₂溶液を作るために RNAse フリー水 10 mL にします。
   2. > 10,000 で溶液を遠心凝集体を解決し、ピペットを使用して上澄みを集め 1 分g x。また、ソリューションをフィルター処理、0.22 μ m フィルターを通過。
2. 在庫の読み込み siRNA の準備
   1. メタンハイド レートまたは RNAse フリー水で 150 μ M に siRNA を薄めます。この原液は避けようと頻繁に凍結融解サイクルが行われないことを考えれば、少なくとも 30 日間-20 ° C で凍結保存します。
3. 塩化カルシウムと pSiNPs の siRNA の読み込み
   1. アイス超音波風呂を準備します。
   2. 下 15 分超音波、siRNA の優しくピペット 150 μ L、700 μ pSiNP の 150 μ L に 2 M CaCl₂ 。ガスの遠心チューブの蓋を開いたままにすることを確認します。
   3. SiRNA ロード カルシウム コーティング pSiNPs、超音波発生装置からの 1 つの mL を含むチューブを取り外します。

4. 脂質の膜融合 siRNA ロード pSiNPs のコーティング

1. リポソーム押出キットの準備
   1. DI 水で広いビーカーを埋めます。ソーク 1 ポリカーボネート膜 (200 nm 毛穴) と水の表面に浮かんでそれら 4 フィルターのサポート。製造元の指示に従い、リポソーム押出キットを組み立てる
2. SiRNA ロード pSiNps と脂質膜の水和
   1. 3.3.3 ステップから取得された siRNA ロード カルシウム コーティング pSiNPs の 1 ml のガラス瓶の乾燥した脂質膜をメタンハイド レートします。ピペットのすべての脂質膜がバイアルの底から持ち上げたし、曇りの同種のソリューションに混在しているまで。
   2. ガラス瓶の磁気撹拌棒を置き、40 ° C (または十分に高いより流体液晶相の脂質を維持するために脂質の相変化温度より上) に粒子を加熱するホット プレートの上に瓶を置く一方、磁気20 分のためのソリューションをかき混ぜます。
3. サイズ コントロールの脂質コーティング pSiNPs を押し出す
   1. 押出シリンジの脂質コーティング pSiNP siRNA 溶液の 1 mL を吸引します。、押出機の片側に空の注射器と反対側に満たされた注射器を挿入します。
   2. 1 シリンジ、ポリカーボネート膜と他の粒子をプッシュするゆっくりピストンを押して、押し出しを開始します。20 回繰り返します。ピストンがスタックしている場合は、フィルター、膜が目詰まり可能性があります。押出機を分解し、膜・ フィルターのサポートを交換します。問題が解決しない場合は、管理が目詰まりするまで粒子を希釈します。
   3. 微量遠心チューブに押し出された粒子を収集します。

5. ペプチドをターゲットの活用

1. 脂質のコーティングにターゲットのペプチドを活用
   1. RNAse フリーの水中ペプチド濃度 1 mg/mL とペプチドのストックを準備します。
   2. 融合ペプチド脂質コーティング pSiNPs を含む遠心チューブ、1 mg/mL ペプチド株式のピペット 100 μ L をそっと追加します。(また、> 2 h 4 ° c) に 20 分間室温でチューブを静的に保存します。
   3. 過剰なペプチド siRNA やその他の賦形剤を削除するには、30 kDa 遠心フィルター 1 h. 遠心 1 ml の PBS の同じ設定でさらに 2 回 25 ° C で 5,000 × gで回して洗ってください。
   4. 必要な濃度で PBS で最終的なペプチド共役融合ペプチド脂質コーティング pSiNPs を再懸濁します。避けようと-80 ° c 少なくとも 30 日間の保存のため冷凍粒子できるようになりました。

結果

融合性 pSiNPs の合成に成功は均質なわずかに不透明なソリューション (図 3 a) を生成する必要があります。比と pSiNPs の濃度を最適化に失敗しました: siRNA: CaCl₂ (図 3 b) の読み込み時に集約につながる可能性があります。DLS を用いて融合ペプチド pSiNPs の平均流体力学的直径が約 200 をする必要があります 200 nm 膜を介...

ディスカッション

ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を図 5に示します。融合性 pSiNPs の合成に重要なステップは、読み込みの手順 (手順 3)。膜融合ナノ粒子を集約する場合後合成 (図 3)、理由次が原因である可能性があります: (1) 塩化カルシウム株式がゆく準備されていません、ステップ 3.1.2 必要があります慎重に続くまたは洗練された; するため(2) または pSiNP ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015