Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung

Zusammenfassung

Wir zeigen die Synthese von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für effektive in vitro und in vivo Oligonukleotid-Lieferung. Poröses Silizium-Nanopartikeln sind beladen mit SiRNA den Kern bilden die durch Fusogenic Lipide durch Extrusion die Shell zu bilden beschichtet ist. Targeting glyko-Funktionalisierung und Partikelcharakterisierung sind im Preis inbegriffen.

Zusammenfassung

Mit dem Aufkommen der Gentherapie ist die Entwicklung einer wirksamen in-vivo-Nukleotid-Nutzlast-Delivery-System der Parallelimport geworden. Fusogenic poröse Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) haben vor kurzem gezeigt, hohen in-vivo Gen-silencing Wirksamkeit aufgrund seiner hohen Oligonukleotid Tragfähigkeit und einzigartige zelluläre Aufnahme Weg, der Endozytose vermeidet. Die Synthese von F-pSiNPs ist ein mehrstufiger Prozess, der enthält: (1) laden und Abdichtung des Oligonukleotids Nutzlasten in den Silizium-Poren; (2) gleichzeitige Beschichtung und Dimensionierung der Fusogenic Lipide um die poröse Silizium-Kerne; und (3) Konjugation von targeting Peptide und waschen um überschüssige Oligonukleotid, Silizium Schmutz und Peptid zu entfernen. Die Partikel Größe Einheitlichkeit zeichnet sich durch dynamische Lichtstreuung und seine Kern-Schale-Struktur von Transmissions-Elektronenmikroskopie überprüft werden kann. Die Fusogenic-Aufnahme ist durch das Laden eines lipophilen validiert färben, 1, 1'-Dioctadecyl-3,3, 3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI), in der Fusogenic-Lipid-Bilayer und behandeln Sie es um Zellen in vitro Plasmamembran Färbung im Vergleich zu beobachten endocytic Lokalisierungen. Targeting und in-vivo Gen-Silencing-Wirksamkeiten wurden zuvor in einem Mausmodell der Staphylococcus Aureus Lungenentzündung, quantifiziert in denen targeting Peptid wird voraussichtlich die F-pSiNPs zu Haus, um den Ort der Infektion zu helfen. Über ihre Anwendung in S. Aureus -Infektion kann das F-pSiNP-System zur jeder Oligonukleotid für Gen-Therapie einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich virale Infektionen, Krebs und Autoimmunerkrankungen zu liefern.

Einleitung

Gentherapie moduliert spezifische Genexpression um ein therapeutisches Ergebnis zu erhalten. Zahlreiche Werkzeuge für gen-Modulation entdeckt und untersucht, einschließlich der Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi) mit Oligonukleotiden (z. B. kurze interferierende RNA (SiRNA)^1,2, MicroRNA (MiRNA)^3,4 ), DNA Plasmide^5,6, Nukleasen (z. B. Zinkfinger, TALENS)^7,8und CRISPR/Cas9 Systeme^9,10. Während jedes Werkzeug Wirkmechanismus unterscheidet, müssen alle Werkzeuge der Zelle Zytoplasma oder Nucleus aktiv sein erreichen. So, während diese Werkzeuge induzieren signifikanten Effekt Modulation der gen-Expression in vitro nachgewiesen haben, leidet die in-vivo Wirksamkeit extrazellulären und intrazellulären Hindernisse. Da die Werkzeuge der biologischen Ursprungs sind, gibt es viele Enzyme und Abfertigungssysteme in unserem Körper, die Fähigkeit zu degradieren oder fremde Moleküle¹¹zu entfernen. Auch in dem Fall, dass die Werkzeuge die Zielzelle erreichen leiden sie Endozytose; ein Modus der zelluläre Aufnahme, die kapselt und fallen die Werkzeuge im sauren Magen-wie Bläschen, die verschlechtern oder die Werkzeuge aus der Zelle zu vertreiben. In der Tat haben Studien gezeigt, dass Lipid Nanopartikel Endocytosed über Macropinocytosis, von denen etwa 70 % der SiRNA aus den Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aufnahme^12,13exocytosed sind. Der Großteil der verbleibenden SiRNA sind durch die lysosomalen Pathway abgebaut und letztlich erreichen nur 1-2 % der SiRNA, die zunächst die Zelle mit den Nanopartikeln betritt Endosomal Flucht potenziell RNAi^{13,14 unterziehen} .

Wir haben vor kurzem Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) entwickelt, die einen SiRNA-geladenen Kern bestehend aus porösem Silizium-Nanopartikeln und Fusogenic Lipid Schale¹⁵haben. Die F-pSiNPs präsentieren drei große Vorteile gegenüber anderen konventionellen Oligonukleotid-Delivery-Systeme: (1) ein Fusogenic Lipid Beschichtung, wodurch die Teilchen zu umgehen Endozytose und liefern die gesamte Nutzlast direkt in das Zytoplasma der Zelle (im Gegensatz zu den 1 %-2 % erzielt durch Endocytosed Partikel^13,14) (Abbildung 1). (2) hohe Masse geladen von SiRNA in der pSiNPs (> 20 Gew.-% im Vergleich zu 1-15 Gew.-% von herkömmlichen Systemen)¹⁵, die schnell im Zytoplasma verschlechtern (Sobald die Core-Partikel die Lipid-Beschichtung über Fusogenic Aufnahme Schuppen), lassen Sie die SiRNA; (3) gezielt Peptid Konjugation für selektive Homing, Zelltypen in-vivo gewünscht.

Die F-pSiNP-System hat bedeutende Gen-silencing Wirksamkeit gezeigt (> 95 % in-vitro-; > 80 % in-vivo) und anschließende therapeutische Wirkung in einem tödlichen Mausmodell der S. Aureus -Pneumonie; die Ergebnisse waren vorher¹⁵veröffentlicht. Allerdings erfordert die komplexe Struktur des F-pSiNP Systems Feingefühl und fein abgestimmte Optimierung, homogen und beständig Nanopartikel zu generieren. So soll der Zweck dieser Arbeit eine gründliche Protokoll sowie Optimierung von Strategien für die Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von F-pSiNPs in gezielte Bereitstellung von SiRNAs für potente Gen-Silencing-Effekt verwendet werden.

Protokoll

1. Zusammenfassung der poröse Silizium-Nanopartikeln (pSINPs)

Achtung: Seien Sie immer vorsichtig, beim Arbeiten mit Fluorwasserstoffsäure (HF). Folgen Sie alle Reiseführer in Sicherheit nach seiner Sicherheitsdatenblatt (SDB) zu, behandeln Sie keine HF-haltigen Chemikalien in einer Dampfhaube und tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA, doppelte Handschuhe mit Butyl Handschuhe auf der Außenseite, Butyl-Schürze mit Laborkittel unter Gesicht Schild mit Schutzbrille unter). Alle Universitäten und Forschungs- und Entwicklungslabors erfordern spezifische Schulungen zu HF-Sicherheit vor dem Gebrauch. Versuchen Sie nicht, mit HF ohne Pre-Approval von Ihrem lokalen Labor Sicherheitskoordinator zu arbeiten, da zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen, die hier nicht beschrieben erforderlich sind.

1. Vorbereitung der Radierung Lösungen
   1. Um die 3:1 HF-Lösung für Radierung (verwendet in Schritte 1.3 und 1.4), füllen Sie eine Plastik machen Schloss Zylinder mit wässrigen 48 % HF 30 mL und 10 mL absolutes Ethanol (EtOH). Die Lösung muss in hoher Dichte Kunststoffe (z. B. HDPE) enthalten sein, wie die HF Glas auflöst.
   2. Zu einem 01:29 Schloss HF-Lösung für Lift-Off (verwendet in Schritt 1.5), füllen Sie eine Plastik Zylinder mit 1 mL wässrige 48 % HF und 29 mL absolutes Ethanol. Die Lösung muss in hoher Dichte Kunststoffe (z. B. HDPE) enthalten sein, wie die HF Glas auflöst.
   3. Machen die 1 M KOH-Lösung in 10 % EtOH für überschüssige pSi Auflösung (verwendet in Schritte 1.3 und 1.5).
2. Einrichten der Etch-Zelle
   1. In einer Teflon Ätzen Zelle mit 8,6 cm² Ätzen gut (Bereich ergibt sich durch die Messung des Durchmessers der Siliziumoberfläche für Radierung innerhalb des o-Rings und Berechnung der Fläche a = πr²), legen Sie in absteigender Reihenfolge (Abbildung 2a): (1) die Teflon Zelle oben; (2) ein o-Ring; (3) ein Viertel Stück der Einkristall (1 0 0) - orientierten p ++ - Typ Silizium-Wafer Vierteln (mit einem Diamantschleifer); (4) Alu-Folie; und (5) die Teflon-Zelle mit Schrauben festgezogen sanft auslaufen zu verhindern.
   2. Füllen Sie den Brunnen mit EtOH. Nehmen Sie ein Tuch und legen Sie in den Spalt zwischen Teflon Zelle oben und unten. Wenn das Tuch trocken nach dem entfernen ist, ist die Ätzen Zelle versiegelt. Wenn nass, die Zelle ist undicht, und ziehen Sie weiter die Schrauben bis versiegelt.
3. Elektropolieren der Silizium-wafer
   1. Bringen Sie die montierte Etch-Zelle in einer Dampfhaube.
   2. Füllen Sie den Brunnen mit 10 mL 3:1-HF-Lösung.
   3. Verbinden Sie die Plusleitung mit Aluminiumfolie (Elektrode) aus der Zelle Ätzen und verbinden Sie das negative Kabel der Platin Spule (Gegenelektrode) eingebettet in der 3:1 HF-Lösung der nächsten Zelle Etch für den Schaltkreis (Abb. 2 b).
   4. Führen Sie eine konstanten Strom bei 50 mA cm^-2 für 60 s. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen, und spülen Sie sorgfältig mit einer Spritze 3:1-HF. Spülen Sie dreimal mit EtOH.
   5. Auflösen entfernt die geätzte Schicht füllen Sie die nun langsam mit 10 mL 1 M KOH. Warten Sie, bis das sprudeln nachlässt.
   6. Spülen Sie die KOH mit Wasser dreimal, und dann mit EtOH dreimal.
4. Elektrochemisch Ätzen poröse Schichten in Silizium-wafer
   1. Führen Sie einen Wechselstrom einer quadratischen Wellenform mit niedrigeren Current density von 50 mA/cm² für 0,6 s und hohe Stromdichte von 400 mA/cm² für 0,36 s für 500 Zyklen wiederholt.
   2. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen, und spülen Sie sorgfältig mit einer Spritze 3:1-HF. Spülen Sie dreimal mit EtOH.
5. Heben Sie die poröse Schicht aus dem Siliziumwafer
   1. Füllen Sie den Brunnen mit 10 mL 01:29 HF-Lösung.
   2. Führen Sie eine konstante von 3,7 mA/cm² für 250 s. Einmal Ätzen ist fertig, die Zelle aus dem Kreislauf zu entfernen. Die pSi-Schicht möglicherweise sichtbare Wellen angibt Loslösung von kristallinen Silizium-Wafer. Vorsichtig waschen Sie, die 01:29 HF-Lösung und spülen Sie mit EtOH dreimal, dann mit Wasser dreimal.
   3. Mit einer Pipettenspitze, fest den Umfang der pSi-Ebene für die vollständige Ablösung zu knacken. Mit EtOH, Ätzen Sie sammeln die pSi-Fragmente (Chips) aus Teflon Zelle in ein mit einem Gewicht von Boot. Übertragen Sie die Chips auf eine Glasflasche. Die pSi-Chips können für mehr als 6 Monaten für die Lagerung bei Raumtemperatur in EtOH gehalten werden.
   4. Lösen sich entfernt alle verbleibenden poröse Silizium auf dem Wafer durch Ausfüllen des Brunnens langsam mit 10 mL 1 M KOH. Warten Sie, bis das sprudeln nachlässt.
   5. Spülen Sie die KOH mit Wasser dreimal, und dann mit EtOH dreimal.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,5, bis die gesamte Waferdicke geätzt wurden.
6. Beschallen poröse Schichten für Nanopartikel Bildung
   1. Das Lösungsmittel der Glasfläschchen mit pSi-Chips von EtOH zu 2 mL VE-Wasser zu ersetzen.
   2. Fest schließen Sie den Deckel und Dichtung mit Parafilm.
   3. Ort das Glas in einem Sonikator Bad Fläschchen und ausgesetzt, so dass das Volumen der pSi-Chips unter der Oberfläche vollständig eingetaucht sind.
   4. Für 12 h bei 35 kHz und HF-Leistung 48W beschallen. Um erhebliche Wasserverlust bei Beschallung zu vermeiden, legen Sie eine volumetrische Flasche gefüllt mit Wasser, invertiert, so dass die Öffnung des Kolbens die Oberfläche des Wasserbades berührt.
   5. Legen Sie die Glasflasche auf eine Ebene Fläche für 1 h erlauben größere Partikel auf dem Boden zu begleichen. Den Überstand mit einer Pipette zu sammeln; die Suspension enthält unter 100 nm pSiNPs.

2. Vorbereitung des Fusogenic-Lipid-film

1. Vorbereitung der Lipid-Stammlösungen
   1. Machen Sie unter einem Abzug 10 mg/mL Bestände von Lipiden durch feuchtigkeitsspendende DMPC, DSPE-PEG-MAL und DOTAP Lipide in Chloroform. Diese Stammlösungen können bis zu 6 Monaten unter engen Parafilm Siegel bei-20 ° C aufbewahrt werden.
2. Die Fusogenic-Lipid-Film zu machen
   Hinweis: Die Fusogenic Zusammensetzung der Lipide, DMPC, DSPE-PEG und DOTAP, das molare Verhältnis von 76.2:3.8:20 und 96.2:3.8:0, bzw. erfolgt auf.
   1. Mischen Sie in eine Glasflasche 72,55 μL DMPC, 15,16 μL der DSPE-PEG und 19.63 μL des DOTAP durch pipettieren.
   2. Optional: Für fluoreszierende Kennzeichnung der Lipid-Beschichtung, zusätzlich schreibe 20 µL DiI in einer Konzentration von 1 mg/mL EtOH aufgelöst.
   3. Legen Sie das Fläschchen in einer Abzugshaube mit einer losen Kappe zu Chloroform über Nacht verdunsten zu lassen. Der getrocknete Film wird eine trübe schwer gelartige Substanz an der Unterseite der Flasche sein.

(3) be- und Abdichtung von SiRNA in pSiNPs

1. Vorbereitung von Kalzium-Chlorid Lager laden
   1. Auflösen von 1,11 g CaCl₂ in 10 mL RNAse-freies Wasser, eine 2 M CaCl₂ -Lösung zu machen.
   2. Zentrifugieren Sie die Lösung bei > 10.000 x g für 1 min zum begleichen der Aggregate und den Überstand mit einer Pipette zu sammeln. Alternativ filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-filter
2. Vorbereitung der SiRNA Lager laden
   1. Hydrat oder die SiRNA bis 150 µM in RNAse-freies Wasser zu verdünnen. Diese Stammlösung möglicherweise regelmÄÑig und für mindestens 30 Tage bei-20 ° C eingefroren aufbewahrt, angesichts der Tatsache, dass es nicht häufigen Frost-Tau-Wechseln unterzogen.
3. Laden die SiRNA in pSiNPs mit Calciumchlorid
   1. Bereiten Sie eine eisgekühlten Beschallung Bad.
   2. Weniger als 15 min Ultraschall, sanft Pipette 150 µL von SiRNA und 700 µL 2 M CaCl₂ in 150 µL des pSiNP. Achten Sie darauf, den Deckel des Microcentrifuge Schlauch für Gaserzeugung offen lassen.
   3. Entfernen Sie die Röhrchen mit 1 mL der SiRNA-geladenen Kalzium beschichtet pSiNPs aus der Sonikator.

(4) Beschichtung SiRNA beladenen pSiNPs mit Fusogenic Lipide

1. Vorbereitung der Liposomen-Extrusion-Kit
   1. Füllen Sie einen großen Becher mit VE-Wasser. Einweichen 1 Polycarbonat Membran (200 nm Poren), und 4 Filter unterstützt durch auf Wasseroberfläche schwimmt. Montieren Sie das Liposomen-Extrusion-Kit, indem Sie nach Anweisungen des Herstellers
2. Feuchtigkeitsspendende Lipid-Film mit SiRNA geladen pSiNps
   1. Die getrockneten Lipid-Film in der Glasflasche mit 1 mL der SiRNA-geladenen Kalzium beschichtet pSiNPs gewonnenen Schritt 3.3.3 Hydrat. Pipette bis alle Lipide Film haben vom Boden des Röhrchens gehoben und in eine trübe homogene Lösung gemischt haben.
   2. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in der Glasflasche, und legen Sie das Fläschchen auf einer Heizplatte, die Partikel auf 40 ° C (oder hoch genug über die Lipide Phase Umwandlungstemperatur weiterhin die Lipide in der mehr fluidische Flüssigkristall-Phase) zu heizen zwar magnetisch Rühren die Lösung für 20 Minuten.
3. Extrudieren der Lipid-beschichtete pSiNPs für Steuerung
   1. Aspirieren Sie 1 mL der Lipid-beschichtete pSiNP-SiRNA-Lösung in der Extrusion Spritze. Legen Sie eine leere Spritze auf der einen Seite des Extruders und die gefüllte Spritze am anderen Ende.
   2. Beginnen Sie Extrusion, indem der Kolben langsam auf die Partikel aus einer Spritze durch die Polycarbonat-Membran und ineinander zu schieben. Wiederholen Sie 20 Mal. Wenn der Kolben klemmt, können der Filter und die Membrane verstopft werden. Zerlegen des Extruders und ersetzen Sie die Membrane und Filter unterstützt. Wenn das Problem weiterhin besteht, verdünnen Sie die Partikel bis Verstopfung überschaubar ist.
   3. Sammeln Sie die extrudierten Partikel zu einem Microcentrifuge Schlauch.

(5) Konjugation von targeting Peptide

1. Konjugation targeting Peptid Lipid-Beschichtung
   1. Bereiten Sie die Peptid-Aktie mit einer 1 mg/mL Peptid-Konzentration in RNAse-freies Wasser.
   2. Im Microcentrifuge Schlauch mit Fusogenic hinzufügen Lipid-beschichteten pSiNPs, 100 µL 1 mg/mL Peptid Lager und Pipettieren sanft. Halten Sie das Rohr statische bei Raumtemperatur für 20 min (Alternativ > 2 h bei 4 ° C).
   3. Um überschüssige Peptid oder SiRNA und anderen Hilfsstoffen zu entfernen, waschen Sie in einem 30 kDa zentrifugale Filter von Spinnen bei 5.000 X g bei 25 ° C für 1 h Zentrifuge noch zweimal mit 1 mL PBS unter die gleiche Einstellung.
   4. Aufschwemmen der endgültigen Peptid konjugiert Fusogenic Lipid-beschichtete pSiNPs mit PBS-Puffer auf die gewünschte Konzentration. Die Partikel können jetzt regelmÄÑig und gefrorenen bei-80 ° C für die Lagerung von mindestens 30 Tage sein.

Ergebnisse

Eine gelungene Synthese aus Fusogenic pSiNPs sollte eine homogene, etwas undurchsichtige Lösung (Abbildung 3a) produzieren. Versagen, das Verhältnis und die Konzentration von pSiNPs zu optimieren: SiRNA: CaCl₂ Aggregation nach dem Laden (Abb. 3 b) führen kann. Wie die Partikel durch 200 nm Membranen extrudiert werden, sollte die hydrodynamische Durchmesser von der Fusogenic pSiNPs DLS gemessen ca. 200 nm, und die du...

Diskussion

Synthese von porösem Silizium-Nanopartikeln ist in Abbildung 5dargestellt. Der entscheidende Schritt bei der Synthese von Fusogenic pSiNPs ist im Laden Schritt (Schritt 3). Wenn die Fusogenic Nanopartikel aggregieren sind Post-Synthese (Abbildung 3), kann aufgrund der folgenden Gründe geben: (1) Kalzium-Chlorid-Lager war nicht homogen bereit, damit Schritt 3.1.2 muss sorgfältig gefolgt oder verfeinert; oder (2) das Verhältnis der pSiNP: SiRNA: CaCl₂

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015