Functionalization, malzemelerin ve Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri'Oligonükleotid dır

Özet

Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri etkili tüp bebek ve içinde vivo Oligonükleotid tesliminde sentezi göstermektedir. Gözenekli Silisyum nano tanecikleri tarafından fusogenic lipidler kabuk oluşturmak için ekstrüzyon ile kaplı çekirdek oluşturmak üzere siRNA ile yüklenir. Hedefleme yan functionalization ve parçacık karakterizasyonu yer almaktadır.

Özet

Gen tedavisi ve advent ile bir etkili içinde vivo nükleotit yükü gönderim sisteminin geliştirilmesi paralel ithalat haline gelmiştir. Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) son zamanlarda yüksek içinde vivo gen etkinliği nedeniyle yükleme kapasitesi ve endositoz önler benzersiz hücresel alımı yolu onun yüksek Oligonükleotid susturmak gösterdi. F-pSiNPs sentezi içeren çok adımlı bir işlemdir: (1) yükleme ve in silikon gözenekleri; Oligonükleotid payloads mühürleme (2) aynı anda kaplama ve fusogenic lipidler gözenekli Silisyum çekirdek çevresinde boyutlandırma; ve peptidler hedefleme ve aşırı Oligonükleotid, silikon enkaz ve peptid kaldırmak için yıkama (3) oluşun. Parçacığın boyutu tekdüzelik dinamik ışık saçılma ile karakterizedir ve çekirdek-kabuk yapısını iletim elektron mikroskobu tarafından doğrulanmadı. Fusogenic alımını bir lipofilik yükleyerek doğrulanır, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (dıı), fusogenic lipid bilayer boya ve hücrelere plazma zarı karşı boyama için gözlemlemek için tüp bebek tedavisi endositik yerelleştirmeler. Hedefleme ve içinde vivo gen silencing efficacies daha önce Staphylococcus aureus pnömoni, hangi hedefleme peptid enfeksiyon sitesine giriş için F-pSiNPs yardım bekleniyor, bir fare modeli sayısal. S. aureus enfeksiyon kendi uygulamasında, F-pSiNP sistemi hastalıkları, viral enfeksiyonlar, kanser ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere geniş bir gen tedavisi için herhangi bir Oligonükleotid teslim etmek için kullanılabilir.

Giriş

Gen tedavisi tedavi edici bir sonuç elde etmek için belirli bir gen ifade modüle. Gen modülasyon için çok sayıda araç keşfetti ve okudu, oligonucleotides (örneğin, kısa sokan RNA (siRNA)^1,2, mikroRNA (miRNA)^{3,4 kullanarak ribonükleik asit girişim de dahil olmak üzere (RNAi)} ), DNA plazmid^5,6, enzimler (örneğin, çinko parmak, TALENS)^7,8ve CRISPR/Cas9 sistemleri^9,10. Her aracın etki mekanizması farklı olsa da, tüm araçları hücrenin sitoplazma veya aktif olmak için çekirdek ulaşmak gerekir. Bu nedenle, bu araçları gen ekspresyonu tüp bebek oransal olarak önemli etkisi ikna etmek için kanıtlanmış olsa da, içinde vivo etkinliği hücre içi ve hücre dışı engel uğrar. Biyolojik kökenlidir araçlar nedeniyle gerçeğini, düşebilir veya yabancı molekülleri¹¹Kaldır seçeneğine sahipsiniz vücudumuzda birçok enzim ve temizleme sistemleri mevcut. Durumda bile araçları hedef hücre ulaşmak endositoz acı; bir mod, saklar ve aşağılamak veya hücre dışı araçlar sınırdışı asitli mide benzeri veziküller araçlarında yakalar hücresel Alım. Aslında, çalışmalar lipid nano tanecikleri içinden alımı^12,1324 h içinde hücrelerden siRNA yaklaşık % 70'i exocytosed macropinocytosis, via endocytosed olduğunu göstermiştir. Kalan siRNA çoğunluğu lizozomal yolu ile bozulmuş ve sonuçta RNAi^{13,14 potansiyel olarak geçmesi endosomal kaçış elde başlangıçta nano tanecikleri ile hücreye girer siRNA, sadece 1-%2} .

Biz son zamanlarda gözenekli Silisyum nano tanecikleri ve fusogenic lipid kabuk¹⁵oluşan bir siRNA yüklenen çekirdek olan fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri (F-pSiNPs) geliştirdik. F-pSiNPs diğer geleneksel Oligonükleotid vasıtalarının üzerinde üç büyük avantajları sunmak: (1) bir fusogenic lipid endositoz bypass ve tüm yükü (1-%2 karşı hücreyi sitoplazmada doğrudan teslim parçacıklar sağlayan kaplama endocytosed parçacıklar^13,14tarafından elde) (Resim 1); pSiNPs siRNA (2) yüksek toplu yükleme (> 20 wt % 1-15 wt % tarafından geleneksel sistemleri ile karşılaştırıldığında) bir kez (çekirdek parçacıkları lipid kaplama fusogenic alımı ile shed) hangi hızla siRNA; serbest bırakmak içinde sitoplazma aşağılamak¹⁵, ve (3) peptid konjugasyon için seçici posta için hedefleme istenen hücre tipleri içinde vivo.

F-pSiNP sistemi önemli gen etkinliğini susturmak göstermiştir (> % 95'in vitro; > % 80'i içinde vivo) ve sonraki tedavi etkisi bir ölümcül fare modeli S. aureus pnömoni; sonuçlarını hangi daha önce¹⁵yayınlandı. Ancak, hassas işleme ve ince ayar en iyi duruma getirme düzgün ve istikrarlı nano tanecikleri oluşturmak için F-pSiNP sisteminin karmaşık yapısını gerektirir. Böylece, bu çalışmanın amacı ayrıntılı bir protokol yanı sıra, functionalization, malzemelerin ve çift hedeflenen teslimini güçlü gen susturmak etkisi için kullanılmak üzere F-pSiNPs için en iyi duruma getirme stratejileri sunmaktır.

Protokol

1. gözenekli Silisyum nano tanecikleri (pSINPs) sentezi

Dikkat: Her zaman hidroflorik asit (HF) ile çalışırken dikkatli olun. Onun güvenlik bilgi formu (SDS) göre tüm güvenlik kılavuzları izleyin, HF içeren herhangi bir kimyasal bir duman başlıklı işlemek ve uygun kişisel koruyucu donanımları (PPE; dış butil eldivenler ile çift eldiven, butil önlük önlük altında yüz ile koruyucu gözlük altında ile kalkan). Bütün üniversiteler ve Ar- Ge laboratuarı kullanım öncesinde HF güvenliği konusunda özel eğitim gerektirir. Burada açıklanmayan ek güvenlik önlemleri gerektiğinden HF ile senin yerel laboratuvar güvenlik koordinatörü ön onayı çalışmak çalışmayın.

1. Gravür çözümleri hazırlanması
   1. Gravür, (kullanılan adımları 1.3 ve 1.4) 3:1 HF çözüm bir plastik dolgu yapmak için silindir sulu % 48 HF 30 mL ve mutlak etanol (alkol) 10 mL ile mezun oldu. HF cam çözülür gibi çözüm yüksek yoğunluklu plastik (örneğin, HDPE) bulunmalıdır.
   2. Bir 1:29 yapmak için kalkış (kullanılan adım 1.5), plastik bir dolgu için HF çözüm silindir 1 mL sulu % 48 HF ve mutlak etanol 29 mL ile mezun oldu. HF cam çözülür gibi çözüm yüksek yoğunluklu plastik (örneğin, HDPE) bulunmalıdır.
   3. 1 M KOH çözüm % 10'luk olun alkol aşırı pSi dağılması (kullanılan adımları 1.3 ve 1.5) için.
2. Etch hücre kurma
   1. Bir Teflon 8,6 cm hücresiyle etch² etch de (alan içinde O-ring aşındırma ve A tarafından alan hesaplama için mevcut silikon yüzeyinin çapı ölçerek hesaplanır πr²=), yer (şekil 2a) azalan düzende: (1) Teflon hücre üst; (2) bir O-ring; (3) çeyrek biteviye-in tek kristal (1 0 0) (elmas kesici kullanarak); dört eşit parçaya kesip - odaklı p ++ - tipi silikon gofret (4) alüminyum folyo; ve (5) Teflon hücre vidayla temel hafifçe sıkılır kaçağı önlemek için.
   2. Kuyu alkol ile doldurun. Bir mendil al ve yarık Bankası ve Teflon hücre üst arasında takabilirsiniz. Silme kaldırma üzerine kuru ise, etch hücre kilitlendi. Islak, hücre sızdırıyor ve sıkın vidaları mühürlü kadar daha.
3. Elektro-parlatma silikon gofret
   1. Birleştirilmiş etch hücre bir duman hood getir.
   2. İyi 10 mL 3:1 HF çözeltisi ile doldurun.
   3. Olumlu kurşun etch hücreden alüminyum folyo (elektrot) bağlanmak ve negatif kurşun devre (şekil 2b) tamamlamak için etch hücre 3:1 HF çözüm batırılır Platin bobin (Counter elektrot) bağlanın.
   4. Geçerli bir sabit 60 50 mA cm^-2 çalıştırın s. Bir kez etch bitti, hücre devre kaldırın ve dikkatli bir şekilde kullanarak 3:1 HF durulayın. Alkol ile üç kez yıkayın.
   5. Kazınmış katman kuyu doldurarak eritmesi 10 mL 1 m KOH ile yavaş yavaş. Köpüren azalır kadar bekleyin.
   6. KOH su üç kere ve o zaman alkol üç kez dışarı durulayın.
4. Mamüllerinin gözenekli katmanları silikon gofret aşındırma
   1. Koşmak bir kare dalga biçimi, bir alternatif akım 0.6 s için 50 mA/cm² alt current density ve 400 mA/cm² 0,36 için yüksek akım yoğunluğu ile s tekrarlanan 500 devredir.
   2. Bir kez etch bitti, hücre devre kaldırın ve dikkatli bir şekilde kullanarak 3:1 HF durulayın. Alkol ile üç kez yıkayın.
5. Silikon gofret gözenekli katmandan kaldırma kapalı
   1. Kuyu 1:29 10 mL ile doldurulması HF çözüm.
   2. Bir sabit 250 için 3.7 mA/cm² çalıştırmak s. Bir kez etch bitti, hücre devre kaldırın. PSi katman dekolmanı kristalin silikon gofret üzerinden gösteren görünür dalgalanmalar olabilir. Yavaşça HF çözüm 1:29 yıkama ve alkol üç kez, sonra üç kez suyla durulayın.
   3. Pipet ucu kullanarak, sıkıca pSi katman tam dekolmanı için çevresi çatlamak. Alkol kullanarak, toplama Teflon üzerinden pSi parçaları (cips) hücre tartı tekneye etch. Fişleri bir cam şişe aktarın. PSi cips alkol içinde oda sıcaklığında 6 ay boyunca Muhafazası için tutulabilir.
   4. Kalan herhangi bir gözenekli silikon gofret üzerinde iyi doldurarak eritmesi 10 mL 1 m KOH ile yavaş yavaş. Köpüren azalır kadar bekleyin.
   5. KOH su üç kere ve o zaman alkol üç kez dışarı durulayın.
   6. Tüm gofret kalınlığı kazınmış 1.3-1.5 tamamlayana dek.
6. Sonicating gözenekli katmanları nanopartikül oluşumu için
   1. DI su 2 mL alkol üzerinden pSi cips içeren cam şişe solvent değiştirin.
   2. Sıkıca kapağı kapatın ve parafilm kullanarak kapatın.
   3. Cam bir sonicator banyosunda şişe ve öyle ki pSi cips hacmi yüzeyden tamamen sular altında askıya bir yer.
   4. 12 h 35 kHz ve 48W gücünü RF için solüsyon içeren temizleyicide. Sonication sırasında önemli su kaybını önlemek için balonun açılması su banyosu yüzeyine dokunduğundan böylece ters, su volumetric flask yerleştirin.
   5. Cam şişe altındaki yerleşmek daha büyük partiküller izin vermek 1 h için düz bir yüzeye yerleştirin. Bir pipet kullanarak süpernatant toplamak; süspansiyon alt-100 nm pSiNPs içerir.

2. fusogenic lipid film hazırlanması

1. Lipid hisse senedi çözümleri hazırlanması
   1. Bir duman başlık, DMPC, DSPE-PEG-MAL ve kloroform DOTAP lipidler nemlendirici lipidler 10 mg/mL stokları olun. Bu hisse senedi çözümler-20 ° C'de 6 ay sıkı parafilm mühür altında tutulabilir.
2. Fusogenic lipid film yapım
   Not: Fusogenic kompozisyon lipidler, DMPC, DSPE-PEG ve DOTAP, 76.2:3.8:20 ve 96.2:3.8:0, molar oranı anılan sıraya göre yapılır.
   1. Bir cam şişede pipetting tarafından DMPC, DSPE-PEG 15.16 μL ve DOTAP 19.63 μL 72.55 μL karıştırın.
   2. İsteğe bağlı: floresan lipid kaplama etiketleme için Ayrıca dıı 20 µL içinde alkol konsantrasyonu 1 mg/mL çözünmüş ekleyin.
   3. Şişeyi bir duman hood gecede buharlaşır kloroform izin vermek için gevşek bir kap ile yerleştirin. Kuru film bir bulutlu zor jel madde şişe dibinde olacak.

3. yükleme ve pSiNPs siRNA, mühürleme

1. Hisse senedi yükleme Kalsiyum klorür hazırlanması
   1. 1.11 CaCl gram dissolve₂ 2 M CaCl₂ çözüm yapmak için su RNAse free 10 ml.
   2. Çözüm > 10.000'santrifüj kapasitesi x g agrega yerleşmek ve bir pipet kullanarak süpernatant toplamak için 1 dakika için. Alternatif olarak, çözüm 0,22 µm filtreden filtre.
2. Hisse senedi yükleme siRNA hazırlanması
   1. Hidrat veya siRNA RNAse free su 150 µM için sulandırmak. Bu hisse senedi çözüm bölünmemeli olabilir ve verilen bu sık donma-çözülme çevrimleri geçmesi değil en az 30 gün-20 ° C'de donmuş devam etti.
3. PSiNPs Kalsiyum klorür ile siRNA yükleme
   1. Bir buzlu sonication Banyosu hazırlamak.
   2. Küçük 15 dk ultrasonication, siRNA yavaşça µL pipet 150 ve 2 M CaCl₂ pSiNP 150 µL içine 700 µL. Gaz üretimi için microcentrifuge tüp kapağını açık bıraktığınızdan emin olun.
   3. SiRNA yüklü kalsiyum kaplı pSiNPs üzerinden sonicator 1 mL içeren tüpü çıkarması.

4. kaplama siRNA yüklü pSiNPs fusogenic lipidler ile

1. Lipozom ekstrüzyon kiti hazırlanması
   1. Geniş bir ölçek DI su ile doldurun. Emmek 1 polikarbonat membran (200 nm gözenekleri) ve onları su yüzeyinde yüzen tarafından 4 filtre destekler. Üreticinin yönergelerini izleyerek lipozom ekstrüzyon kiti montajı
2. SiRNA yüklü pSiNps lipid filmle nemlendirici
   1. 3.3.3 adımından elde siRNA yüklü kalsiyum kaplı pSiNPs, 1 mL ile cam şişe kurutulmuş lipid filmde hidrat. Kadar tüm lipidler film şişe altından kaldırdın ve bulutlu bir homojen çözüm karışık pipet.
   2. Manyetik bir karıştırma çubuğu cam şişede getirin ve şişeyi parçacıklar 40 ° C (veya yukarıda lipidler faz dönüşümü sıcaklık daha akışkan sıvı kristal aşamasında lipidler korumak için yeterince yüksek) ısı sıcak bir tabak üzerine yerleştirin manyetik olarak süre 20 dk için çözüm karıştırma.
3. Boyut kontrolü için lipid kaplı pSiNPs yükseltme
   1. Ekstrüzyon şırınga çözümde lipid kaplı pSiNP-siRNA 1 mL Aspire edin. Ekstruder bir tarafındaki boş bir şırınga ve diğer ucu dolgulu şırıngayı takın.
   2. Ekstrüzyon yavaş yavaş parçacıklar--dan bir tenkıye, polikarbonat membran aracılığıyla ve diğer içine itmek için pistonu iterek başlayın. 20 kere tekrar edin. Piston takılırsa, filtre ve membran tıkanmış. Ekstruder sökmeye ve membran ve filtre destekler değiştirin. Sorun devam ederse, tıkanma yönetilebilir olana parçacıklar oranında seyreltin.
   3. Microcentrifuge tüp içine haddelenmiş parçacıkları toplamak.

5. konjugasyon peptidler hedefleme

1. Lipid kaplama için hedefleme peptid conjugating
   1. 1 mg/mL ile peptid stok peptid konsantrasyon RNAse free su hazırlamak.
   2. Fusogenic lipid kaplı pSiNPs içeren microcentrifuge tüpte 1 mg/mL peptid hisse senedi ve damlalıklı 100 µL yavaşça ekleyin. Tüp, oda sıcaklığında 20 dakika (alternatif olarak, > 2 h 4 ° C'de) statik tutun.
   3. Aşırı peptid veya siRNA ve diğer eksipientleri kaldırmak için 5000 x g 1 h. santrifüj PBS 1 mL aynı ayarı altında ile iki kez daha fazla için 25 ° c de iplik tarafından 30 kDa santrifüj filtre olarak yıkayın.
   4. Son fusogenic peptid Birleşik pSiNPs lipid kaplı PBS içinde istenen konsantrasyonu resuspend. Parçacıklar şimdi bölünmemeli ve en az 30 gün depolamak için-80 ° C'de donmuş olabilir.

Sonuçlar

Fusogenic pSiNPs başarılı bir sentezi (şekil 3a) homojen, biraz opak bir çözüm üretmek gerekir. Başarısızlık oranı ve pSiNPs konsantrasyonu en iyi duruma getirmek için: siRNA: CaCl₂ (şekil 3b) yükleme üzerine toplama için neden olabilir. Parçacıklar 200 nm membranlar uzatılır, fusogenic pSiNPs DLS tarafından ölçülen ortalama hidrodinamik çapı yaklaşık 200 olmalıdır nm ve

Tartışmalar

Gözenekli Silisyum nano tanecikleri sentezi şekil 5' te gösterilen. Fusogenic pSiNPs sentezi kritik adımda yükleme adım (Adım 3) var. Fusogenic nano tanecikleri toplayarak Eğer sonrası sentezi (şekil 3), nedeni aşağıdaki nedeniyle olabilir: (1) Kalsiyum klorür stok rastlanılmaması hazırlanan değil, böylece adım 3.1.2 olmalı dikkatle takip veya rafine; veya (2) pSiNP oranı: siRNA: CaCl₂ veya bir veya daha fazla üç bileşeni kons...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015