Síntese e caracterização de nanopartículas de silício poroso de Fusogenic para a entrega do Oligonucleotide Functionalization

Resumo

Demonstramos a síntese de nanopartículas de silício poroso fusogenic para entrega efectiva do oligonucleotide in vitro e in vivo. Nanopartículas de silício poroso são carregadas com siRNA para formar o núcleo, que é revestido por fusogenic lipídios através da extrusão para formar o reservatório. Direcionamento functionalization moiety e caracterização de partículas estão incluídos.

Resumo

Com o advento da terapia gênica, tornou-se o desenvolvimento de um sistema de entrega eficaz em vivo do nucleotide-carga de importação paralela. Nanopartículas de silício poroso de Fusogenic (F-pSiNPs) recentemente demonstraram alto vivo em eficácia devido a sua alta do oligonucleotide carregar a capacidade e a via de absorção celular exclusivo que evita a endocitose de silenciamento do gene. A síntese de F-pSiNPs é um processo de várias etapa que inclui: (1) carregamento e selagem de payloads do oligonucleotide nos poros do silicone; (2) revestimento simultâneo e dimensionamento de lipídios fusogenic em torno dos núcleos de silício poroso; e (3) conjugação de direcionamento de peptídeos e de lavagem para remover o excesso do oligonucleotide, detritos de silício e peptídeo. Uniformidade de tamanho da partícula é caracterizada pela difusão dinâmica da luz, e sua estrutura casca-núcleo pode ser verificada por microscopia eletrônica de transmissão. A absorção de fusogenic é validada por carregar um lipofílico tingir, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DiI), para a fusogenic lipídica e tratá-la às pilhas in vitro para observar para coloração contra a membrana plasmática endocítica localizações. As direcionamento e in vivo eficácias silenciar do gene anteriormente foram quantificadas em um modelo do rato de pneumonia de Staphylococcus aureus , em que o peptídeo alvo é esperado para ajudar o F-pSiNPs a casa para o local da infecção. Além da sua aplicação na infecção por S. aureus , o sistema F-pSiNP pode ser usado para entregar qualquer do oligonucleotide para a terapia de gene de uma vasta gama de doenças, incluindo doenças auto-imunes, câncer e infecções virais.

Introdução

Terapia genética modula a expressão de genes específicos para obter um resultado terapêutico. Inúmeras ferramentas para modulação de genes foram descobertas e estudadas, incluindo ácido ribonucleico interferência (RNAi) usando oligonucleotídeos (por exemplo, curto interferência do RNA (siRNA)^1,2, microRNA (miRNA)^3,4 ), DNA plasmídeo^5,6, nucleases (por exemplo, dedo de zinco, TALENS)^7,8e CRISPR/Cas9 sistemas^9,10. Enquanto mecanismo de cada ferramenta de ação é diferente, todas as ferramentas devem alcançar o citoplasma da célula ou o núcleo para ser ativo. Como tal, embora estas ferramentas têm comprovado para induzir um efeito significativo na modulação de expressão gênica in vitro, a eficácia in vivo sofre entraves extracelulares e intracelulares. Devido ao fato de que as ferramentas são de origem biológica, muitas enzimas e sistemas de limpeza existem em nosso corpo que têm a capacidade de degradar ou remover as moléculas estrangeiras¹¹. Mesmo no caso que as ferramentas atingem a célula-alvo, eles sofrem de endocitose; um modo de captação celular que encapsula e prende as ferramentas em vesículas ácidas do estômago-como que degradam ou expulsar as ferramentas fora da célula. De fato, estudos têm mostrado que nanopartículas de lipídios são endocytosed através de macropinocitose, da qual cerca de 70% do siRNA são exocytosed das células dentro de 24h de captação^12,13. A maior parte do restante siRNA é degradada através da via lisossomal, e em última análise, apenas 1-2% de siRNA que inicialmente entra na célula com as nanopartículas alcançar CDDP fuga potencialmente submeter-se a RNAi^13,14 .

Recentemente desenvolvemos a nanopartículas de silício poroso de fusogenic (F-pSiNPs) que têm um núcleo de siRNA-carregado composto de nanopartículas de silício poroso e um fusogenic lipídica shell¹⁵. Os F-pSiNPs apresenta três grandes vantagens sobre outros sistemas de entrega convencional do oligonucleotide: (1) um lipídio fusogenic revestimento que permite que as partículas de ignorar a endocitose e entregar a carga inteira diretamente no citoplasma celular (contra o 1-2% alcançado por partículas de endocytosed^13,14) (Figura 1); (2) alto carregamento em massa de siRNA no pSiNPs (> 20% em peso em comparação com 1-15% em peso por sistemas convencionais)¹⁵, que rapidamente degradar no citoplasma (uma vez que as partículas do núcleo derramou o revestimento lipídico através de captação de fusogenic) para liberar o siRNA; e (3) visando a conjugação de peptídeo para orientação seletiva para desejado tipos de células in vivo.

O sistema F-pSiNP demonstrou silenciamento eficácia significativa do gene (> 95% in-vitro; > 80% in vivo) e o subsequente efeito terapêutico em um modelo de mouse fatal de S. aureus pneumonia; os resultados dos quais foram anteriormente publicados¹⁵. No entanto, a estrutura complexa do sistema F-pSiNP requer manipulação delicada e otimização de aperfeiçoá-lo para gerar nanopartículas uniformes e estáveis. Assim, o objetivo deste trabalho é apresentar um protocolo completo, bem como estratégias de otimização para a síntese, functionalization e caracterização de F-pSiNPs para ser usado no alvo entrega de siRNAs para efeito silencioso potente gene.

Protocolo

1. síntese de nanopartículas de silício poroso (pSINPs)

Cuidado: Sempre tenha cuidado ao trabalhar com ácido fluorídrico (HF). Siga todas as guias de segurança, de acordo com sua ficha de dados de segurança (SDS), lidar com quaisquer produtos químicos que contenham HF em uma coifa e usar equipamento de protecção adequado (EPI; luvas duplas com luvas de butilo do lado de fora, butil avental com jaleco e por baixo, rosto proteger com óculos de segurança por baixo). Todas as universidades e laboratórios de p & D requerem treinamento específico sobre segurança de HF antes do uso. Não tente trabalhar com HF sem aprovação prévia do seu coordenador de segurança do laboratório local, pois são necessárias medidas de segurança adicionais não descritas aqui.

1. Preparação das soluções de decapagem
   1. Para tornar a solução de HF de 3:1 para a gravura (usada em passos 1.3 e 1.4), preencher um plástico graduado cilindro com 30 mL de HF aquoso de 48% e 10 mL de etanol absoluto (EtOH). A solução deve estar contida em plásticos de alta densidade (por exemplo, PEAD), como o HF dissolve vidro.
   2. Tornar um 01:29 solução de HF para decolagem (usado no passo 1.5), preencher um plástico graduado cilindro com 1 mL de HF aquoso de 48% e 29 mL de etanol absoluto. A solução deve estar contida em plásticos de alta densidade (por exemplo, PEAD), como o HF dissolve vidro.
   3. Faça a solução KOH 1 M em 10% EtOH para dissolução de excesso libras por polegada quadrada (usada em passos 1.3 e 1.5).
2. Configurando a célula etch
   1. Em um Teflon etch célula com um 8,6 cm² etch bem (área é calculada medindo o diâmetro da superfície de silício disponível para gravura dentro o-Ring e calcular a área pela = πr²), coloque em decrescente (Figura 2a): (1) o Top de célula de Teflon; (2) um-Ring; (3) um pedaço do bairro do único cristal (1 0 0) - orientada p + + - tipo bolacha de silicone cortada em quartos (usando um cortador de diamante); (4) folha de alumínio; e (5) a célula de Teflon base com parafusos apertados suavemente para evitar fugas.
   2. Encha o poço com EtOH. Pegue uma limpeza e introduza a fenda entre o Teflon celular topo ea base. Se a limpeza for seca após a remoção, a célula etch está selada. Se molhado, a célula está vazando e aperte os parafusos mais até selado.
3. Polimento electrolítico o wafer de silício
   1. Trazer a célula etch montado em uma coifa.
   2. Encha o poço com 10 mL de solução de HF de 3:1.
   3. Ligue para a folha de alumínio (eletrodo) a positivo da célula etch e conectar o cabo negativo para as molas de platina (Counter-eletrodo) imergida em solução de HF a 3:1 da célula de etch para completar o circuito (Figura 2b).
   4. Executar uma constante corrente de 50 mA cm^-2 por 60 s. Uma vez etch é terminado, remover a célula do circuito e enxaguar o HF de 3:1 com cuidado, usando uma seringa. Enxágue com EtOH três vezes.
   5. Dissolverem a camada gravada através do preenchimento do poço lentamente com 10 mL de 1m KOH. Espere até a subida diminui.
   6. Enxague com água três vezes e depois com EtOH três vezes o KOH.
4. Eletroquimicamente gravura camadas porosa em bolacha de silicone
   1. Executar uma corrente alternada de uma forma de onda quadrada, com menor current density de 50 mA/cm² para 0,6 s e alta densidade de corrente de 400 mA/cm² para 0,36 s repetiu para 500 ciclos.
   2. Uma vez etch é terminado, remover a célula do circuito e enxaguar o HF de 3:1 com cuidado, usando uma seringa. Enxágue com EtOH três vezes.
5. Levantando-se a camada porosa do wafer de silício
   1. Encher o poço com 10 mL de 01:29 solução de HF.
   2. Executar uma constante de 3.7 mA/cm² para 250 s. Uma vez etch é terminado, remover a célula do circuito. A camada de pSi pode ter ondulações visíveis indicando distanciamento da pastilha de silício cristalino. Delicadamente, lavar as 01:29 solução de HF e enxágue com EtOH três vezes e, em seguida, com água três vezes.
   3. Usando a ponta da pipeta, firmemente rachar a circunferência da camada pSi para completo desapego. Usando EtOH, recolher os fragmentos de libras por polegada quadrada (fichas) do Teflon etch célula em um pesagem do barco. Transferi as fichas para um frasco de vidro. Os chips de pSi podem ser mantidos à temperatura ambiente em EtOH por mais de 6 meses para armazenamento.
   4. Dissolverem qualquer restante silício poroso sobre a bolacha preenchendo o bem devagar com 10 mL de 1m KOH. Espere até a subida diminui.
   5. Enxague com água três vezes e depois com EtOH três vezes o KOH.
   6. Repita as etapas de 1,3-1,5 até a espessura da bolacha inteira tem sido gravada.
6. Sonicating camadas porosas para formação de nanopartículas
   1. Substitua o solvente do frasco de vidro contendo fichas de pSi de EtOH a 2 mL de água Desionizada.
   2. Firmemente feche a tampa e selar usando parafilme.
   3. Lugar do vidro frasco em um banho do sonicador e suspenso de tal forma que o volume de chips libras por polegada quadrada é completamente submerso abaixo da superfície.
   4. Proceda à sonicação durante 12 horas a 35 kHz e potência de RF de 48W. Para evitar a perda de água significativa durante sonication, coloque um balão volumétrico preenchido com água, invertida de modo que a abertura do frasco toque a superfície do banho de água.
   5. Coloque o frasco de vidro sobre uma superfície plana de 1 h permitir que as partículas maiores resolver na parte inferior. Recolher o sobrenadante com uma pipeta; a suspensão contém pSiNPs sub-100 nm.

2. preparação do filme de lipídios fusogenic

1. Preparação das soluções estoque de lipídeos
   1. Em uma coifa, fazer estoques de 10 mg/mL de lipídios por hidratante ácido, DSPE-PEG-MAL e lipídios DOTAP em clorofórmio. Essas soluções estoque podem ser mantidas a-20 ° C por até 6 meses sob selo apertado parafilme.
2. Tornando o filme de lipídios fusogenic
   Nota: A composição do fusogenic é composta de lipídios, ácido, DSPE-PEG e DOTAP, para a relação molar de 76.2:3.8:20 e 96.2:3.8:0, respectivamente.
   1. Em um frasco de vidro, misture 72,55 μL de ácido e 15.16 μL de DSPE-PEG 19.63 μL de DOTAP pipetando.
   2. Opcional: Para rotulagem fluorescente do revestimento lipídico, além disso adicione 20 µ l de DiI dissolvido em EtOH numa concentração de 1 mg/mL.
   3. Coloque o frasco em uma coifa com uma tampa solta para permitir que o clorofórmio evapore durante a noite. O filme seco será uma substância de gelatinosa dura nublada na parte inferior do frasco.

3. carregamento e selagem de siRNA em pSiNPs

1. Preparação do cloreto de cálcio carregar estoque
   1. Dissolver 1,11 g de CaCl₂ em 10 mL de água livre de RNAse para fazer uma solução de₂ CaCl 2 M.
   2. Centrifugue a solução no > 10.000 x g por 1 min resolver os agregados e recolher o sobrenadante com uma pipeta. Alternativamente, filtre a solução através de um filtro de 0,22 µm.
2. Preparação do siRNA carregar estoque
   1. Hidratar ou diluir o siRNA para 150 µM em água livre de RNAse. Esta solução pode ser aliquotada e mantidas congelada a-20 ° C durante pelo menos 30 dias dado que, não sofrer ciclos de congelamento-descongelamento frequentes.
3. Carregando o siRNA em pSiNPs com cloreto de cálcio
   1. Prepare um banho gelado sonication.
   2. Abaixo dos 15 min ultrasonication, delicadamente pipeta 150 µ l de siRNA e 700 µ l de 2 M CaCl₂ em 150 µ l de pSiNP. Certifique-se de deixar a tampa do tubo microcentrifuga aberta para geração de gás.
   3. Retire o tubo contendo 1 mL de siRNA-carregado cálcio revestido pSiNPs partir do sonicador.

4. revestimento siRNA-carregado pSiNPs com lipídios fusogenic

1. Preparação do kit de extrusão do lipossoma
   1. Encha um copo grande com água. Mergulhe 1 policarbonato membrana (200 nm poros) e 4 suportes de filtro por eles flutuando na superfície da água. Montar o kit de extrusão em lipossomas, seguindo as instruções do fabricante
2. Hidratação do filme lipídico com siRNA-carregado pSiNps
   1. Hidrate o filme lipídico secas no frasco de vidro com 1 mL de siRNA-carregado cálcio revestido pSiNPs obtidos de passo 3.3.3. Pipete até todos os lipídios filme ter levantado do fundo do frasco e misturado em uma solução homogênea nublada.
   2. Coloque uma barra de agita magnética no frasco de vidro e coloque o frasco em um prato quente para aquecer as partículas de 40 ° C (ou alto o bastante acima da temperatura de transformação de fase dos lipídeos para manter os lipídios na fase de cristal líquido mais fluídico) enquanto magneticamente agitar a solução por 20 min.
3. Expulsando os pSiNPs revestidos de lipídeos para controle de tamanho
   1. Aspire a 1 mL de solução de pSiNP-siRNA revestidos de lipídeos na seringa extrusão. Inserir uma seringa vazia de um lado da extrusora e a seringa na outra extremidade.
   2. Extrusão de Begin, empurrando o êmbolo lentamente para empurrar as partículas de uma seringa, através da membrana de policarbonato e para o outro. Repita 20 vezes. Se o pistão é preso, o filtro e a membrana podem estar entupidos. Desmonte a extrusora e substituir os suportes de membrana e filtro. Se o problema persistir, dilua as partículas até o entupimento é gerenciável.
   3. Recolha as partículas extrudadas em um tubo de microcentrifugadora.

5. conjugação de alvejar peptides

1. Conjugação de peptídeo direcionamento para revestimento de lipídios
   1. Prepare o estoque de peptídeo com um 1 mg/mL de concentração de peptídeo em água livre de RNAse.
   2. No tubo de microcentrifugadora contendo fusogenic pSiNPs revestidos de lipídeos, adicionar 100 µ l do estoque de peptídeo de 1 mg/mL e pipeta suavemente. Mantenha o tubo estático em temperatura ambiente por 20 min (Alternativamente, > 2 h a 4 ° C).
   3. Para remover o excesso peptídeo ou siRNA e outros excipientes, lavar em um filtro centrífugo 30 kDa por fiação a 5.000 x g a 25 ° C, durante 1 h. centrífuga mais duas vezes com 1 mL de PBS sob a mesma configuração.
   4. Resuspenda o pSiNPs final fusogenic conjugados a peptídeo de revestidos de lipídeos em PBS na concentração desejada. As partículas podem agora ser aliquotadas e congeladas a-80 ° C para armazenamento pelo menos 30 dias.

Resultados

Uma síntese bem sucedida de fusogenic pSiNPs deve produzir uma solução homogênea, ligeiramente opaca (Figura 3a). Falha para otimizar a relação e a concentração de pSiNPs: siRNA: CaCl₂ pode levar a agregação durante o carregamento (Figura 3b). Como as partículas são extrudadas através de membranas de 200 nm, o diâmetro médio hidrodinâmico da pSiNPs de fusogenic medidos por DLS deve ser aproximadamente 2...

Discussão

Síntese de nanopartículas de silício poroso é mostrado na Figura 5. O passo fundamental na síntese de fusogenic pSiNPs está na etapa de carregamento (etapa 3). Se as nanopartículas fusogenic são agregar pós-síntese (Figura 3), o motivo pode ser devido ao seguinte: (1) estoque de cloreto de cálcio não foi homogênea preparado, assim passo 3.1.2 deve ser cuidadosamente seguido ou refinado; ou (2) a relação de pSiNP: siRNA: CaCl₂ ou a conce...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015