JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем синтеза наночастиц fusogenic пористого кремния для эффективного в vitro и in vivo олигонуклеотида доставки. Пористого кремния наночастиц загружаются с siRNA сформировать ядро, которое покрыно fusogenic липиды путем экструзии для формирования корпуса. Нацеленности остаток функционализации и гранулометрического состава.

Аннотация

С появлением генной терапии разработка системы доставки эффективной в естественных условиях нуклеотида грузоподъемность стала параллельного импорта. Fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs) недавно продемонстрировали высокий в-vivo гена, глушителей эффективность из-за его высокой олигонуклеотида загрузки способности и уникальные клеточного поглощения путь, который избегает эндоцитоза. Синтез F-pSiNPs представляет собой многоэтапный процесс, который включает в себя: (1) Загрузка и герметизации полезных олигонуклеотида в порах кремния; (2) одновременно покрытие и калибровки fusogenic липидов вокруг ядра пористого кремния; и (3) спряжение ориентации пептидов и мойка для удаления избыточных олигонуклеотида, кремния мусора и пептида. Однородность размера частицы характеризуется Динамическое рассеяние света, и его структура ядро оболочка может быть проверена путем просвечивающей электронной микроскопии. Fusogenic усвоение проверяется путем загрузки липофильных красителя, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (дии), в fusogenic липидного бислоя и рассматривая его клетки in vitro соблюдать плазматической мембраны, окрашивание по сравнению с endocytic локализаций. Ориентации и in vivo гена глушителей узкоспециализированного ранее были количественно в мышиной модели пневмонии золотистый стафилококк , в котором, как ожидается, помочь F-pSiNPs в дом к месту инфекции таргетинга пептид. Помимо его применения в инфекции S. aureus F-pSiNP система может использоваться для доставки любого олигонуклеотида для генной терапии широкого спектра заболеваний, в том числе вирусные инфекции, рак и аутоиммунные заболевания.

Введение

Генная терапия модулирует конкретный ген выражение для получения терапевтические результаты. Многочисленные инструменты для модуляции гена были обнаружены и изучены, включая рибонуклеиновой кислоты вмешательства (RNAi) с помощью олигонуклеотиды (например, короткие интерферирующие РНК (siRNA)1,2, микроРНК (miRNA)3,4 ), ДНК плазмиды5,6, nucleases (например, цинковый палец, ТАЛЕНС)7,8и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем9,10. Хотя механизм действия каждого инструмента отличается, все инструменты должны достичь цитоплазмы клетки или ядро быть активными. Таким образом хотя эти инструменты доказали, чтобы вызвать значительный эффект в модуляции экспрессии генов в пробирке, в естественных условиях эффективность страдает от внеклеточные и внутриклеточных препятствий. С тем, что инструменты являются биологического происхождения, многие ферменты и распродажа систем существуют в нашем теле, которые имеют возможность снизить или удалить иностранных молекул11. Даже в случае инструменты достижения целевую ячейку, они страдают от эндоцитоз; режим клеточного поглощения, который инкапсулирует и ловушки инструменты в кислой желудка как пузырьки, которые деградируют или высылать инструменты из клетки. В самом деле исследования показали, что наночастицы липидов являются endocytosed через макропиноцитозом, из которых около 70% малых интерферирующих РНК exocytosed от клеток в течение 24 ч поглощения12,13. Большинство из оставшихся малых интерферирующих РНК деградации через лизосомальных пути, и в конечном итоге лишь 1-2% малых интерферирующих РНК, которая первоначально проникает в клетку с наночастицами добиться от англ побег подвергаться потенциально RNAi13,14 .

Мы недавно разработали fusogenic пористого кремния наночастиц (F-pSiNPs), у малых интерферирующих РНК загружается ядро, состоящий из пористого кремния наночастиц и липидов оболочки fusogenic15. F-pSiNPs представляют три основных преимущества перед другими системами доставки обычных олигонуклеотида: (1) fusogenic липидов, покрытие, что позволяет частицы обойти эндоцитоза и доставить все полезные данные непосредственно в цитоплазме клеток (по сравнению с 1-2% достигнутые endocytosed частицы13,14) (рис. 1); (2) высокая массовой загрузки интерферирующей РНК в pSiNPs (> 20 wt % по сравнению с 1-15 wt % обычных систем)15, который быстро деградируют в цитоплазме (после основных частиц пролить липидного покрытия через fusogenic поглощения) для выпуска малых интерферирующих РНК; и (3) ориентации пептид сопряжения для селективного самонаведения для желаемого типы клеток в естественных условиях.

F-pSiNP система продемонстрировала значительный Джин глушителей эффективность (> 95% в пробирке; > 80% в естественных условиях) и последующего терапевтического эффекта в роковой мыши модели S. aureus пневмонии; результаты которого были опубликованы ранее15. Однако сложная структура системы F-pSiNP требует осторожного обращения и доработаны оптимизации для создания единообразной и стабильной наночастиц. Таким образом цель этой работы – представить подробный протокол, а также стратегий оптимизации для синтеза, функционализации и характеристика F-pSiNPs использоваться в адресности малые интерферирующие РНК для глушителей эффект мощным ген.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. синтез наночастиц пористого кремния (pSINPs)

Предупреждение: Всегда будьте осторожны при работе с фтористоводородную кислоту (HF). Выполните все руководства по безопасности согласно ее лист данным по безопасности (ПБ), обрабатывать любые ВЧ содержащих химические вещества в зонта и носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ; двойных перчаток с бутил перчатки на внешней стороне, бутил фартук с пальто лаборатории под, лицо щит с очки под). Все университеты и научно -исследовательских лабораторий требуют специальной подготовки по ВЧ безопасности перед использованием. Не пытаться работать с ВЧ без предварительного одобрения координатора по вопросам безопасности вашей местной лаборатории, которые требуются дополнительные меры безопасности не описанные здесь.

  1. Подготовка травильных растворов
    1. Чтобы сделать 3:1 ВЧ раствора для травления (используется в шаги 1.3 и 1.4), заполнить пластиковый окончил цилиндр с водный 48% HF по 30 мл и 10 мл абсолютного этанола (EtOH). Решения должны содержаться в высокой плотности пластмассы (например, HDPE), как HF растворяет стекла.
    2. Чтобы сделать 1:29 кв решение для взлета (используется в шаге 1.5), заполнить в пластиковые окончил цилиндр с 1 мл водного раствора 48% HF и 29 мл абсолютного этанола. Решения должны содержаться в высокой плотности пластмассы (например, HDPE), как HF растворяет стекла.
    3. Сделать решение Кох 1 M 10% EtOH для растворения избыток pSi (используется в шаги 1.3 и 1.5).
  2. Настройка ячейки etch
    1. Тефлон etch клеток с 8,6 см2 хорошо etch (площадь вычисляется путем измерения диаметра поверхности кремния для травления в кольцо и вычисление площади, A = πr2), место в убывающем порядке (Рисунок 2a): (1) Тефлон ячейки сверху; (2) кольцо; (3) часть квартала одного кристалла (1 0 0) - ориентированной p ++ - типа кремниевой пластины, разрезать на четверти (с помощью алмазного резца); (4) алюминиевая фольга; и (5) тефлон ячейку база с винтами нежно затянуты для предотвращения утечки.
    2. Заполнение скважины с EtOH. Возьмите wipe и вставьте в расщелину между верхней ячейки тефлон и базы. Если протрите сухой после удаления, запечатан в etch ячейку. Если мокрый, ячейка протекает и затяните винты дальше пока не опечатаны.
  3. Электрополировка кремниевой пластины
    1. Принесите собрал etch ячейки в зонта.
    2. Заполнение скважины с 10 мл раствора 3:1 кв.
    3. Подключите положительный провод к алюминиевой фольги (электрод) из etch ячейки и подключите отрицательный провод к Платиновый катушки (борьбы с электродом) погружен в раствор HF 3:1 etch ячейки для завершения схемы (рис. 2b).
    4. Запуск постоянного тока в 50 мА см-2 для 60 s. Когда-то etch закончен, удалить ячейки из цепи и промыть тщательно с помощью шприца ВЧ 3:1. Промойте с EtOH три раза.
    5. Распустить прочь травления слоя, заполнив колодец медленно с 10 мл 1 м Кох. Подождите, пока восходящей спадает.
    6. Промойте Кох водой три раза, а затем с EtOH три раза.
  4. Электрохимически травления пористые слои в кремниевой пластины
    1. Запуск переменного тока квадратные волны, с Нижняя current density 50 мА/см2 для 0.6 s и высокая плотность тока 400 мА/см2 для 0,36 s повторяется для 500 циклов.
    2. Когда-то etch закончен, удалить ячейки из цепи и промыть тщательно с помощью шприца ВЧ 3:1. Промойте с EtOH три раза.
  5. Лифтинг офф пористый слой из кремниевой пластины
    1. Заполнение скважины с 10 мл 1:29 кв решение.
    2. Запуск константа 3.7 мА/см2 250 s. Когда-то etch закончен, удалить ячейки из цепи. PSi слой может иметь видимых рябь, указывающее отрешенности от кристаллический кремниевой пластины. Осторожно промыть 1:29 раствор HF и промойте с EtOH три раза, а затем с водой три раза.
    3. С помощью кончика пипетки, твердо трещины окружности pSi слоя для полный отряд. С помощью EtOH, собирать фрагменты pSi (чипов) с тефлоновым etch клеток в весом лодку. Передачи чипов стекла флакона. Фишки pSi может храниться при комнатной температуре в EtOH в течение 6 месяцев для хранения.
    4. Распустить прочь любые оставшиеся пористого кремния на пластины, заполнив колодец медленно с 10 мл 1 м Кох. Подождите, пока восходящей спадает.
    5. Промойте Кох водой три раза, а затем с EtOH три раза.
    6. Повторите шаги 1.3-1.5 травленная толщина всего пластин.
  6. Sonicating пористые слои для формирования наночастиц
    1. Замените растворителя флакон стекла, содержащие pSi фишки с EtOH до 2 мл воды ди.
    2. Плотно закройте крышку и печать с использованием парафина.
    3. Место стекла флаконе в ванне с sonicator и приостановлено, таким образом, чтобы объем pSi фишек полностью погружена ниже поверхности.
    4. Sonicate для 12 h 35 кГц и RF Мощность 48W. Чтобы предотвратить потерю значительных воды во время sonication, место объемные колбу с водой, таким образом, чтобы открытие колбу касается поверхности водяной бани.
    5. Место стеклянный флакон на плоскую поверхность для 1 h разрешить крупные частицы оседают на дне. Собирать супернатанта, с помощью пипетки; суспензии содержит pSiNPs суб-100 Нм.

2. Подготовка fusogenic липидной пленки

  1. Подготовка решений фондовых липидов
    1. В Зонта сделать 10 мг/мл запасы липидов, увлажняющая DMPC, DSPE-PEG-MAL и DOTAP липидов в хлороформе. Эти акции решения могут храниться при-20 ° C до 6 месяцев опечатанном туго парафина.
  2. Создание фильма липидов fusogenic
    Примечание: Состав fusogenic производится из липидов, DMPC, DSPE-КОЛЫШЕК и DOTAP, на молярное соотношение 76.2:3.8:20 и 96.2:3.8:0, соответственно.
    1. В стеклянный флакон Смешайте 72.55 мкл DMPC, 15,16 мкл DSPE-КОЛЫШЕК и 19,63 мкл DOTAP, закупорить.
    2. Опционально: Люминесцентные маркировки липидного покрытия, дополнительно добавьте 20 мкл DiI растворяют в EtOH в концентрации 1 мг/мл.
    3. Поместите ампулу в Зонта с потерять колпачок разрешить метилхлороформа на ночь испарится. Высушенные пленки будет облачно твердое вещество гелеобразной в нижней части флакона.

3. Загрузка и герметизация малых интерферирующих РНК в pSiNPs

  1. Подготовка хлорида кальция, Загрузка фондовой
    1. Распустить 1,11 g CaCl2 в 10 мл РНКазы свободной воды, чтобы сделать раствор2 2м CaCl.
    2. Центрифуга для решения > 10 000 x g 1 мин урегулировать агрегатов и собирать с помощью пипетки супернатант. Кроме того фильтр решение через фильтр 0,22 мкм.
  2. Подготовка siRNA, Загрузка фондовой
    1. Гидрат или разбавлять siRNA до 150 мкм в РНКазы свободной воды. Этот раствор может быть aliquoted и хранятся замороженные при температуре-20 ° C для по крайней мере 30 дней, учитывая, что он не подвергается циклов часто замораживания оттаивания.
  3. Загрузка малых интерферирующих РНК в pSiNPs с хлорид кальция
    1. Подготовьте Ванна ледяной sonication.
    2. 15 мин ultrasonication, нежно дозатор 150 мкл siRNA и 700 мкл CaCl 2 М2 в 150 мкл pSiNP. Убедитесь в том оставить открытой крышке пробки microcentrifuge для газа поколения.
    3. Снять трубку, содержащую 1 мл pSiNPs загружен siRNA кальция с покрытием из sonicator.

4. покрытие siRNA загружен pSiNPs с fusogenic липиды

  1. Подготовка комплекта экструзии липосом
    1. Заполните широкий стакан с водой ди. Выдержите 1 поликарбоната мембраны (200 Нм поры) и 4 фильтр поддерживает путем их плавает на поверхности воды. Соберите комплект экструзии липосом, следуя инструкциям производителя
  2. Гидратирующий липидов фильм с малых интерферирующих РНК загружена pSiNps
    1. Увлажнения сушеные липидных Фильм в стеклянный флакон с 1 мл раствора загружен siRNA кальция с покрытием pSiNPs, полученные от шага 3.3.3. Пипетка до тех пор, пока все липиды фильм подняли со дна флакона и смешались в пасмурный однородный раствор.
    2. Магнитный перемешивания бар в стеклянный флакон и поместите ампулу на горячей пластине для нагрева частиц до 40 ° C (или достаточно высокий, выше липиды фазы преобразования температуры для поддержания липидов в более жидкой фазе жидкий кристалл) магнитно хотя Перемешивание раствора на 20 мин.
  3. Экструзия липидов покрытием pSiNPs для размера элемента управления
    1. Аспирационная 1 мл раствора липидов покрытием pSiNP-малых интерферирующих РНК в шприц экструзии. Вставьте пустой шприц на одной стороне экструдера и заполненный шприц на другом конце.
    2. Начала экструзии толкает поршень медленно толкать частицы от одного шприца, через мембрану из поликарбоната и в другой. Повторите 20 раз. Если поршень застрял, фильтр и мембраны может быть засорен. Разберите экструдера и Замените мембрану и фильтр поддерживает. Если проблема сохраняется, разбавляют частицы до тех пор, пока засорения является управляемым.
    3. Соберите экструдированные частицы в пробки microcentrifuge.

5. спряжение таргетинга пептиды

  1. Спряжение таргетинга пептид липидного покрытия
    1. Подготовьте запас пептид с 1 мг/мл концентрация пептида в РНКазы свободной воды.
    2. В пробки microcentrifuge, содержащие fusogenic липидов покрытием pSiNPs, добавить 100 мкл пептид 1 мг/мл и пипетки осторожно. Держите трубку статические при комнатной температуре в течение 20 минут (в качестве альтернативы, > 2 ч при температуре 4 ° C).
    3. Чтобы удалить избыток пептид или siRNA и другие наполнители, стирать в 30 кДа центробежного фильтра спиннинг на 5000 x g при 25 ° C в течение 1 ч. Центрифуга вдвое больше с 1 мл PBS под те же настройки.
    4. Ресуспензируйте окончательный конъюгированных пептидные fusogenic липидов покрытием pSiNPs в PBS в нужной концентрации. Частицы могут теперь быть aliquoted и замороженные при температуре-80 ° C для хранения по крайней мере 30 дней.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Успешный синтез fusogenic pSiNPs следует производить однородный, слегка непрозрачные решения (рис. 3a). Неспособность оптимизировать соотношение и концентрации pSiNPs: siRNA: CaCl2 может привести к агрегации после загрузки (рис. 3b). Поскольку част?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

На рисунке 5показан синтеза наночастиц пористого кремния. Важным шагом в синтезе fusogenic pSiNPs находится в Загрузка шаг (шаг 3). Если объединение наночастиц fusogenic после синтеза (рис. 3), причиной может быть связано следующее: (1) хлорид кальция запасов не было под?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

MJS является основателем научной спинакер Biosciences, Inc. и владеет долей в компании.  Хотя этот грант был определен порядок управления конфликтом интересов, на основе общей сферы охвата проекта и его потенциальную выгоду для спинакер Biosciences, Inc., результаты исследований, включенных в этой конкретной публикации может не обязательно относятся к интересам спинакер Biosciences, Inc. Условия этого соглашения были рассмотрены и утверждена в университете Калифорнии, Сан-Диего в соответствии со своей политикой конфликта интересов. Другие авторы имеют ничего не разглашать.

Благодарности

Эта работа поддерживается национальными институтами здравоохранения через контракт # R01 AI132413-01.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)Avanti Polar Lipids850345PPowder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)Avanti Polar Lipids890890PPowder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)Avanti Polar Lipids880126PPowder
Aluminum foilVWR International, LLC12175-001
Calcium chloride (CaCl2)SpectrumC1977Anhydrous, Pellets
ChloroformFisher ScientificC6061
ComputerDellDimension 9200Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))Life TechnologiesD3911
Ethanol (EtOH)UCSD Store111200 Proof
Hydrofluric acid (HF)VWR International, LLCMK264008 Purity: 48%
Keithley 2651a SourcemeterKeithley2651A
LabVIEWNational InstrumentsSample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26Thermo Fisher ScientificL7526
Liposome extrusion set with heating blockAvanti Polar Lipids610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter UnitEMD MilliporeMRCF0R030
O-ringChemGlassCG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-049
Platinum coilVWR International, LLCAA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)Fisher ScientificP250-3
Silicon waferSiltronixCustom order
siRNADharmaconCustom orderIRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
SonicatorVWR International, LLC97043-960
Targeting peptide (CRV)CPC ScientificCustom ordersequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cellInterface Performance Materials, Inc.Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific10977015

Ссылки

  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5(2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151(2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104(2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738(2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349(2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911(2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969(2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613(2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146nanomedicinesiRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены