합성과 기능화, Oligonucleotide 배달에 대 한 Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 특성

요약

우리는 효과적인 생체 외에서 그리고 vivo에서 oligonucleotide 배달 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자의 합성을 보여 줍니다. 다공성 실리콘 나노 껍질을 형성 하기 위하여 압출을 통해 fusogenic 지질에 의해 코팅은 핵심을 형성 하는 siRNA와 함께 로드 됩니다. 타겟팅 moiety 기능화 및 입자 특성화 포함 되어 있습니다.

초록

유전자 치료의 도래와 함께 효과적인 vivo에서 뉴클레오티드-페이로드 전달 시스템의 개발의 병행 수입 되고있다. Fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F-pSiNPs)은 최근 높은 생체 조건 유전자 침묵 때문에 용량과 endocytosis를 방지 하는 독특한 세포 통풍 관 통로 로드 하는 높은 oligonucleotide 효능 설명 했다. F-pSiNPs의 합성은 포함 하는 다단계 프로세스: (1) 로드 및 실리콘 모;에서 oligonucleotide 페이로드 씰링 (2) 동시 코팅 및 다공성 실리콘 코어; 주위 fusogenic 지질의 크기 조정 그리고 펩 티 드를 지정 하 고 초과 oligonucleotide, 실리콘 파편, 및 펩 티 드를 제거 하는 세척의 (3) 활용. 그리고 동적 산란, 입자의 크기가 균일 특징 이다 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 그것의 코어-쉘 구조를 확인할 수 있습니다. Fusogenic 이해는 질 성 로드 하 여 유효성을 검사할 염색, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 (DiI), fusogenic 지질 bilayer에 고 대 얼룩 원형질 막에 대 한 관찰을 생체 외에서 세포 치료 endocytic 있어입니다. 대상 및 생체 조건 유전자 입을 신진대사 이전 대상 펩 티 드 F-pSiNPs의 가정 감염의 사이트에 도움 것으로 예상 된다 황색 포도상구균 폐 렴의 마우스 모델에서 정량 했다. S. 구 균 감염에의 응용, 넘어 F-pSiNP 시스템 바이러스 감염, 암, 자가 면역 질환 등 질병의 광범위의 유전자 치료에 대 한 어떤 oligonucleotide를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서문

유전자 치료는 치료 결과 얻기 위해 특정 유전자 발현을 조절 한다. 유전자 변조에 대 한 수많은 도구 발견 되었고 ribonucleic 산 간섭 (RNAi) oligonucleotides (예를 들어, 짧은 간섭 RNA (siRNA)^1,2, 예측에 관한 (미르)^{3,4 사용 하 여 포함 하 여 공부} ), DNA 플라스 미드^5,6, nucleases (예, 아연 손가락, TALENS)⁸,^7,및 CRISPR/Cas9 시스템^9,10. 작업의 각 도구의 메커니즘 다릅니다, 하는 동안 모든 도구 셀의 세포질 또는 활성 핵을 도달 해야 합니다. 따라서, 이러한 도구 유도 생체 외에서 유전자 발현 조절에 중요 한 영향을 입증 했다, 하는 동안 생체 조건 효 험 extracellular와 세포 장애물에서 겪고 있다. 사실은 도구는 생물학 근원의 이다, 많은 효소 및 허가 시스템 저하 또는 외국 분자¹¹제거 능력을가지고 우리 몸에 존재 합니다. 경우에도 그들은 endocytosis;에서 고통 받는 도구에 도달 목표 셀 캡슐화 하 고 산 성 위 같은 vesicles 저하 또는 셀에서 도구를 추방 하는에서 도구를 트랩 세포질 통풍 관의 모드입니다. 실제로, 연구는 지질 나노 입자는 약 70%는 siRNA의 통풍 관^12,13의 24 시간 이내 셀에서 exocytosed는 macropinocytosis 통해 endocytosed 나타났습니다. 나머지 siRNA의 대다수는 lysosomal 통로가 통해 타락 및 궁극적으로 처음가 나노 입자와 셀 siRNA의 유일한 1-2% 달성 잠재적으로 RNAi^{13,14 endosomal 이스케이프} .

최근 fusogenic 다공성 실리콘 나노 입자 (F pSiNPs) 다공성 실리콘 나노 입자와 fusogenic 지질 셸¹⁵의 구성 하는 siRNA 로드 코어를 개발 했습니다. 세 가지 주요 이점을 다른 기존의 oligonucleotide 전달 시스템을 제시 하는 F-pSiNPs: (1) fusogenic 지질 endocytosis를 무시 하 고 (1-2% 대 세포 세포질에 직접 전체 페이로드를 전달 하는 입자를 가능 하 게 코팅 endocytosed 입자^13,14달성) (그림 1); (2) 높은 대량 로드는 pSiNPs에 siRNA의 (> 20 wt % 기존의 시스템에 의해 1-15 wt %에 비해)¹⁵, 급속 하 게 타락 세포질에 (일단 코어 입자 fusogenic 통풍 관을 통해 지질 코팅 창 고) 출시 siRNA; (3) 세포 유형 vivo에서 원하는 대상에 선택적 추적에 대 한 펩 티 드 활용.

F-pSiNP 시스템 효능 입을 중요 한 유전자를 시연 하고있다 (> 95% 생체 외에서; > 80 %vivo에서) 및 S. 구 균 폐 렴;의 치명적인 마우스 모델에서 후속 치료 효과 결과 출판 이전¹⁵. 그러나, F-pSiNP 시스템의 복잡 한 구조는 섬세 한 처리 및 생성 하는 균일 하 고 안정 된 나노 입자를 미세 조정된 최적화 필요 합니다. 따라서,이 작품의 목적은 철저 한 프로토콜 합성과 기능화, 같은 강력한 유전자 입을 효과 siRNAs의 대상된 배달에 사용 될 F-pSiNPs의 특성에 대 한 최적화 전략 제시 하는 것 이다.

프로토콜

1. 다공성 실리콘 나노 입자 (pSINPs)의 합성

주의: 화 수 소산 (HF)을 작업할 때는 항상 주의 사용 합니다. 그것의 안전 데이터 시트 (SDS) 모든 안전 지침을 따르십시오, 연기 후드, HF 포함 된 화학 물질을 처리 하 고 적절 한 개인 보호 장비 (PPE, 외부에 부 틸 장갑 이중 장갑, 랩 코트 밑, 얼굴 부 틸 앞치마를 착용 아래 안전 고글 방패). 모든 대학 및 R & D 연구소 HF 안전 사용 이전에 특정 교육이 필요합니다. 여기에 설명 되지 않은 추가적인 안전 대책도 필요으로 로컬 실험실 안전 조정자의 사전 승인 없이 HF를 사용 하지 마십시오.

1. 에칭 솔루션의 준비
   1. 3:1 HF에 대 한 솔루션 에칭 (단계 1.3과 1.4에서 사용), 플라스틱을 채우기 있도록 수성 48 %HF 30 mL와 10 mL 절대 에탄올 (EtOH)의 실린더를 졸업 했다. 솔루션으로는 HF 유리를 녹이 고 고밀도 플라스틱 (예: 고밀도 폴 리 에틸렌)에 포함 되어야 합니다.
   2. 1시 29분을 이륙 (1.5에서 사용된 단계), 플라스틱을 채우기 위한 HF 솔루션 1 mL의 수성 48 %HF 절대 에탄올의 29 mL와 실린더를 졸업 했다. 솔루션으로는 HF 유리를 녹이 고 고밀도 플라스틱 (예: 고밀도 폴 리 에틸렌)에 포함 되어야 합니다.
   3. 10%에서 1 M 코 솔루션 만들기 EtOH 초과 pSi 해산 (단계 1.3과 1.5에서 사용).
2. Etch 셀 설정
   1. 테 플 론에서 8.6 cm 셀 엣지² 잘 엣지 (지역 o-링, 내 에칭 하 고 A에 의해 영역을 계산 하는 데 사용할 수 있는 실리콘 표면의 직경을 측정 하 여 계산 = πr²), 내림차순 (그림 2a)에: (1)는 테 플 론 셀 가기; (2) 링; (3) 단 결정의 4 분의 1 조각 (1 0 0)-지향적인 p + +-유형 실리콘 웨이퍼 (다이아몬드 커터를 사용 하 여); 내 무 반으로 잘라 (4) 알루미늄 호 일; (5) 테 플 론 셀 베이스 나사를 부드럽게 누설을 방지 하기 위해 강화.
   2. EtOH에 잘 채워. 닦 고 테 플 론 셀 상단과 기지 사이 틈새에 삽입. 제거 시 건조 닦아 이면 엣지 셀 밀봉 된다. 젖은, 셀 누출 되 고 강화 하는 경우 나사 밀봉 될 때까지 더.
3. 실리콘 웨이퍼 연마
   1. 증기 두건으로 조립된 etch 셀을 가져.
   2. 3:1 HF 용액 10 mL에 잘 채워.
   3. Etch 셀에서 긍정적인 리드를 알루미늄 호 일 (전극)에 연결할 연결 부정적인 리드 백 금 코일 (카운터 전극) 회로 (그림 2b)를 완료 하는 etch 셀의 3:1 HF 용액에 몰입 하 고.
   4. 정 전류 50 mA cm^-2 60에서 실행 s. 일단 엣지 완료 되 면, 회로에서 셀을 제거 하 고 3:1 HF 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 밖으로 헹 굴. 세 번 EtOH 린스 합니다.
   5. 잘 작성 하 여 에칭된 레이어를 멀리 해산 1 M 코의 10 mL를 천천히. 버블링가 라 앉 다 때까지 기다립니다.
   6. 물을 세 번, 그리고 EtOH 3 번 코를 씻어.
4. 실리콘 웨이퍼에 다공성 층을 화학적 에칭
   1. 사각 파형의 교류 전류 50 mA/cm² 0.6 s의 낮은 current density와 400 mA/cm² 0.36의 높은 전류 밀도 실행 s 500 사이클 반복.
   2. 일단 엣지 완료 되 면, 회로에서 셀을 제거 하 고 3:1 HF 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 밖으로 헹 굴. 세 번 EtOH 린스 합니다.
5. 해제-실리콘 웨이퍼에서 다공성 계층에서
   1. 1시 29분의 10 mL 잘 채워 HF 솔루션.
   2. 3.7 mA/cm² 250의 상수 실행 s. 일단 엣지 완료 되 면, 회로에서 셀을 제거. PSi 레이어 표시 파문 나타내는 결정 실리콘 웨이퍼에서 분리를 할 수 있습니다. 부드럽게 HF 솔루션 1시 29분에 밖으로 세척 하 고 EtOH 3 번, 그 후에 세 번 물으로 씻어.
   3. 완전 한 분리에 대 한 pSi 계층의 둘레를 균열 단단히 피 펫 팁을 사용 하 여. EtOH를 사용 하 여 수집 된 테 플 론에서 pSi 조각 (칩) 에칭 셀 무게 보트로. 유리 제 작은 유리병에 칩을 전송. PSi 칩 저장을 위해 6 개월 이상 EtOH에 실내 온도에 보관 수 있습니다.
   4. 잘 작성 하 여 모든 나머지 다공성 실리콘 웨이퍼에 멀리 분해 1 M 코의 10 mL를 천천히. 버블링가 라 앉 다 때까지 기다립니다.
   5. 물을 세 번, 그리고 EtOH 3 번 코를 씻어.
   6. 1.3-1.5 단계를 반복 하 여 전체 웨이퍼 두께 에칭.
6. Sonicating 다공성 층 나노 입자 형성에 대 한
   1. 디 물 2 ml EtOH에서 pSi 칩이 포함 된 유리 유리병의 용 매를 교체 합니다.
   2. 단단히 뚜껑을 닫고 parafilm를 사용 하 여 밀봉.
   3. 유리 sonicator 목욕에서 유리병 및 중단 pSi 칩의 볼륨은 표면 아래에 완전히 빠져들 것 같은 장소.
   4. 12 h 35 kHz 및 RF 전력 48W의 sonicate. 쥡니다 동안 중요 한 물 손실 방지, 플라스 크의 여 물 목욕의 표면 접촉 되도록 반전 물으로 채워진 부피 플라스 크를 배치 합니다.
   5. 유리 약 병을 1 h 더 큰 입자는 아래쪽에 정착를 허용 하기 위해 평평한 표면에 놓습니다. 상쾌한 피 펫;를 사용 하 여 수집 정지에는 하위-100 nm pSiNPs를 포함 되어 있습니다.

2입니다. fusogenic 지질 필름 준비

1. 지질 재고 솔루션의 준비
   1. 증기 두건에서 DMPC, DSPE-말뚝-말 및 클로 프롬에 DOTAP 지질 수 화에 의해 지질 10 mg/mL 주식을 확인 합니다. 이러한 재고 솔루션 꽉 parafilm 물개에서 최대 6 개월 동안-20 ° C에 보관 수 있습니다.
2. Fusogenic 지질 필름 만들기
   참고: fusogenic 구성이 이루어집니다 지질, DMPC, DSPE-말뚝, 및 DOTAP, 76.2:3.8:20 및 96.2:3.8:0의 어 금 니 비율에서 각각.
   1. 유리 병, DMPC, DSPE-말뚝의 15.16 μ 및 DOTAP의 19.63 μ 72.55 μ pipetting으로 혼합.
   2. 선택 사항: 형광 라벨 지질 코팅, 또한 추가 DiI의 20 µ L 1 mg/mL의 농도에 EtOH에 녹아.
   3. 하룻밤 증발을 클로 프롬 있도록 느슨한 모자와 함께 증기 두건에서 유리병을 놓습니다. 건조 필름 유리병의 하단에 흐린 하드 젤 같은 물질을 될 것입니다.

3. 로드 하 고 pSiNPs에 siRNA의 씰링

1. 재고를 로드 하는 염화 칼슘의 준비
   1. 1.11 g CaCl의 분해2 M CaCl₂ 솔루션 RNAse 무료 물 10 mL에₂ .
   2. > 10, 000에서 솔루션 원심 집계를 정착 하는 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 수집 1 분 동안 g x. 또는, 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
2. 재고를 로드 하는 siRNA의 준비
   1. 수 화 또는 RNAse 무료 물에서 150 µ m siRNA를 희석. 이 재고 솔루션 aliquoted 수 있으며 자주 freeze-thaw 주기를 받아야 하지 않습니다는 적어도 30 일 동안-20 ° C에서 냉동 보관.
3. 염화 칼슘과 pSiNPs에 siRNA를 로드
   1. 아이스 쥡니다 목욕을 준비 합니다.
   2. 15 분 ultrasonication, siRNA의 부드럽게 피 펫 150 µ L 및 pSiNP의 150 µ L에 2 M CaCl₂ 의 700 µ L. 가스 생성을 위한 microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 열어두고 해야 합니다.
   3. 포함 하는 sonicator에서 siRNA 로드 칼슘 코팅 pSiNPs의 1 mL 튜브를 제거 합니다.

4. 코팅 fusogenic 지질와 siRNA 로드 pSiNPs

1. Liposome 압출 장비의 준비
   1. 디 물으로 넓은 비 커를 채우십시오. 담가 1 폴 리카 보 네이트 막 (200 nm 모 공), 그리고 물 표면에 떠 여 4 필터 지원 제조업체의 지침에 따라 liposome 압출 키트 조립
2. SiRNA 로드 pSiNps와 함께 지질 영화 하이드레이팅
   1. 3.3.3 단계에서 얻은 siRNA 로드 칼슘 코팅 pSiNPs의의 1 mL와 함께 유리 유리병에 말린된 지질 영화 하이드 레이트. 플라스틱 모든 지질 영화 유리병의 바닥에서 고 흐린 동종 솔루션으로 혼합 때까지.
   2. 유리 병에 자석 교 반 막대를 배치 하 고 40 ° C (또는 높은 만큼 더 유체 액체 크리스탈 단계에 지질을 유지 하기 위해 지질 위상 변환 온도 이상) 입자가 열 하는 뜨거운 접시에 유리병을 배치 하면서 자석으로 20 분에 대 한 솔루션을 감동.
3. 돌출 크기 제어에 대 한 지질 코팅 pSiNPs
   1. 압출 주사기에 지질 코팅 pSiNP-siRNA 솔루션의 1 mL 발음 압출 기의 1 개의 측에 빈 주사기와 다른 쪽 끝에 채워진된 주사기를 삽입 합니다.
   2. 천천히 한 주사기, 폴 리카 보 네이트 막 통해 그리고 다른로에서 입자를 추진 하는 피스톤 밀고 하 여 압출을 시작 합니다. 20 회 반복 한다. 피스톤 붙어있다 면 필터와 멤브레인 막힌 될 수 있습니다. 압출 기를 분해 하 고 멤브레인 및 필터 지원 교체. 문제가 지속 되 면, 관리는 막힘 때까지 입자를 희석.
   3. Microcentrifuge 관으로 밀어낸된 입자를 수집 합니다.

5입니다. 펩 티 드를 타겟팅의 활용

1. 대상 펩타이드 지질 코팅을 변화
   1. 1 mg/mL와 펩 티 드 주식 RNAse 무료 물에 펩 티 드 농도 준비 합니다.
   2. Fusogenic를 포함 하는 microcentrifuge 관에서 지질 코팅 pSiNPs, 부드럽게 1 mg/mL의 펩 티 드 사진 및 피펫으로 100 µ L를 추가 합니다. 튜브 20 분 (또는 > 2 h 4 ° C에서)에 대 한 실 온에서 정적 유지.
   3. 초과 펩 티 드 또는 siRNA와 다른 소를 제거 하려면 1 h. 동일한 설정에서 PBS의 1 mL와 함께 두 번 더 원심 분리기 25 ° C에서 5000 x g 에서 회전 하 여 30 kDa 원심 필터에 세척.
   4. 원하는 농도에서 PBS에 마지막 펩 티 드 활용 fusogenic 지질 코팅 pSiNPs를 resuspend. 입자 지금 aliquoted 및 적어도 30 일 저장을 위한-80 ° C에서 냉동 수 있습니다.

결과

Fusogenic pSiNPs의 성공적인 합성 균질 성, 약간 불투명 한 솔루션 (그림 3a)를 생산 한다. 실패 비율 및 pSiNPs의 농도 최적화: siRNA: CaCl₂ (그림 3b) 로딩 시 집계 될 수 있습니다. 입자는 200 nm 세포 막을 통해 돌출 되어, DL로 측정 하는 fusogenic pSiNPs의 평균 유체역학 직경 해야한다 약 200 nm, 그리고 그림 4와 ?...

토론

다공성 실리콘 나노 입자의 합성은 그림 5에 표시 됩니다. 로딩 단계 (3 단계)에서 fusogenic pSiNPs의 합성에 중요 한 단계가입니다. Fusogenic 나노 입자는 집계 하는 경우 후 합성 (그림 3), 이유는 다음과 같은 원인일 수 있습니다: (1) 염화 칼슘 주식 homogenously 준비 되지 않았습니다, 따라서 단계 3.1.2 신중 하 게 따라 하거나 해야 세련 된; (2) 또는 pSiNP의 비율: ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	Powder
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP)	Avanti Polar Lipids	890890P	Powder
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)	Avanti Polar Lipids	880126P	Powder
Aluminum foil	VWR International, LLC	12175-001
Calcium chloride (CaCl2)	Spectrum	C1977	Anhydrous, Pellets
Chloroform	Fisher Scientific	C6061
Computer	Dell	Dimension 9200	Any computer with PCI card slot is acceptable
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))	Life Technologies	D3911
Ethanol (EtOH)	UCSD Store	111	200 Proof
Hydrofluric acid (HF)	VWR International, LLC	MK264008	Purity: 48%
Keithley 2651a Sourcemeter	Keithley	2651A
LabVIEW	National Instruments		Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526
Liposome extrusion set with heating block	Avanti Polar Lipids	610000
Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	MRCF0R030
O-ring	ChemGlass	CG-305-220
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Platinum coil	VWR International, LLC	AA10285-BU
Potassium hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-3
Silicon wafer	Siltronix	Custom order
siRNA	Dharmacon	Custom order	IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’
Sonicator	VWR International, LLC	97043-960
Targeting peptide (CRV)	CPC Scientific	Custom order	sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues
Teflon etch cell	Interface Performance Materials, Inc.	Custom order
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015