رصد الاستعمار البكتيري والصيانة على جذور الثاليانية العربية في نظام مائي عائم

Summary

هنا نقوم بوصف اختبار نمو النباتات المائية لتحديد وجود الأنواع وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا أثناء الاستعمار الأولي لجذور النباتات وبعد نقلها إلى بيئات نمو مختلفة.

Abstract

تشكل البكتيريا ميكروبيومات جذمور معقدة على شكل ميكروبات متفاعلة، وكائنات أكبر، والبيئة اللاأحيائية. في ظل الظروف المختبرية، يمكن أن يزيد استعمار الجذوسفير من قبل البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB) من صحة أو تطوير النباتات المضيفة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة. ومع ذلك، في البيئات الميدانية، غالباً ما لا توفر العلاجات البكتيرية مع PGPB فوائد كبيرة للمحاصيل. أحد التفسيرات هو أن هذا قد يكون بسبب فقدان PGPB أثناء التفاعلات مع الميكروبات التربة الذاتية على مدى عمر النبات. وكان من الصعب تأكيد هذه الإمكانية، لأن معظم الدراسات تركز على الاستعمار الأولي بدلا ً من الإبقاء على PGPB داخل مجتمعات الجذمور. ومن المفترض هنا أن التجمع والتعايش والحفاظ على المجتمعات البكتيرية تتشكل من خلال السمات الحتمية للبيئة الدقيقة الجذمورفيس، وأن هذه التفاعلات قد تؤثر على بقاء PGPB في البيئات الأصلية. لدراسة هذه السلوكيات، يتم تحسين اختبار نمو النبات المائي باستخدام أرابيدوبسي ثاليانا لتحديد وتصور التوزيع المكاني للبكتيريا خلال الاستعمار الأولي لجذور النبات وبعد الانتقال إلى نمو مختلف البيئات. ثم يتم التحقق من إمكانية استنساخ هذا النظام وفائدته مع PGPB Pseudomonas simiaeالمدروسة جيدا . للتحقيق في كيفية وجود أنواع بكتيرية متعددة قد تؤثر على الاستعمار وديناميات الصيانة على جذر النبات، مجتمع نموذجي من ثلاث سلالات بكتيرية (Arthrobacter، Curtobacterium،وMicrobacterium الأنواع) معزولة أصلا من تم بناء الجذمورفيس الثاليا. ويتضح أن وجود هذه الأنواع البكتيرية المتنوعة يمكن قياسه باستخدام هذا الفحص المائي للنباتات والتيار اللاين، الذي يوفر بديلا ً للدراسات المجتمعية البكتيرية القائمة على التسلسل. قد تحسن الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذا النظام فهم السلوك البكتيري في الميكروبيوم النباتية متعددة الأنواع مع مرور الوقت وفي الظروف البيئية المتغيرة.

Introduction

تدمير المحاصيل من الأمراض البكتيرية والفطرية يؤدي إلى انخفاض إنتاج الأغذية ويمكن أن تعطل بشدة الاستقرار العالمي¹. استنادا ً إلى اكتشاف أن الميكروبات في التربة المثبطة هي المسؤولة عن زيادة صحة النبات^2،سأل العلماء ما إذا كان يمكن الاستفادة من ميكروبيوم النبات لدعم نمو النبات عن طريق تعديل وجود ووفرة خاصة [ترجم للعربية ] البكتيريا التي تم العثور عليها للمساعدة في نمو النبات أو التنمية تسمى مجتمعة البكتيريا التي تعزز نمو النبات (PGPB). وفي الآونة الأخيرة، تحولت الدراسات من مجرد تحديد PGPB المحتملة إلى فهم كيف أن التفاعلات بين الممالك في التربة، حول الجذور، أو في الغلاف الجذي (المنطقة المحيطة مباشرة بما في ذلك سطح الجذر) قد تؤثر على PGPB النشاط⁴.

يمكن للاستعمار Rhizosphere من قبل PGPB زيادة الصحة أو تطوير النباتات المضيفة استجابة لعوامل الإجهاد المتنوعة بالنسبة للنباتات غير المستعمرة⁵. ومع ذلك، غالباً ما تكون النتائج أكثر تغيراً في ظروف التربة الأصلية مقارنة بتلك التي لوحظت في الدفيئة والمختبرات التي يتم التحكم فيها عن كثب⁶. فرضية واحدة لهذا الاختلاف هو أن نمو أو سلوك PGPB قد تكون تمنعها بكتيريا التربة الأصلية أو الفطريات في الحقول^7،8. الآثار المفيدة من قبل بكتيريا جذمور تعتمد عموما على قدرة البكتيريا إلى 1) تحديد موقع والتحرك نحو الجذر، 2) استعمار الجذر من خلال تشكيل biofilm، و 3) التفاعل مع النبات المضيف أو مسببات الأمراض عن طريق إنتاج جزيء صغير الأيض^7،9. أي من هذه السلوكيات الاستعمارية قد تتأثر بوجود ونشاط الميكروبات المجاورة¹⁰.

قمنا بتصميم نظام لتحديد وتصور هذه المراحل الاستعمارية البكتيرية المتميزة من الجذمورسفير (الشكل1). ومن شأن هذا النهج أن ييسر الدراسات التي تحقق في سبب عدم ملاحظة صيانة الـ PGPB الطويلة الأجل في بعض الأحيان بعد نقل النباتات إلى بيئات جديدة، مثل زراعة الشتلات قبل التلقيح. تم اختيار أرابيدوبسي ثاليانا كنموذج نباتي نظراً لاستخدامه الواسع في الدراسات المختبرية وكذلك البيانات الوافرة المتاحة عن تفاعلاته الميكروبية^11. هناك ثلاث مراحل في النظام: 1) A. تاليانا النمو، 2) الاستعمار البكتيري، و 3) الصيانة البكتيرية (انظر الشكل1). لأن A. thaliana هو نبات أرضي، كان من المهم التأكد من أنه لا يعاني من الإجهاد المائي لا مبرر له في النظام المائي¹². مستوحاة من الأساليب المستخدمة من قبل هاني وآخرون¹³، وتزرع الشتلات على شبكة بلاستيكية لفصل تبادل لاطلاق النار من وسط النمو السائل. هذا النظام لا يبدو أن المساس بصحة وتطوير المضيف النبات، وأنه يحسن A. تاليانا النمو في السائل¹¹. كما يطفو تبادل لاطلاق النار النبات فوق السطح، تتعرض الجذور تماما للاستعمار من قبل البكتيريا تلقيح في وسط النمو البكتيري السائل. وهذا يسمح للبكتيريا ذات الأهمية لفحصها للاستعمار في المواد الغذائية التي هي الأكثر ملاءمة للنمو، في حين تحول الظروف للسماح للنبات لمواصلة النمو في وسط المغذيات المصممة لدعم نموها. وتشمل كلتا المرحلتين الهز المستمر لمنع أنوكسيا من الجذر¹³. يمكن تصور البكتيريا أو قياسها كميامن جذور النبات بعد نقلها إما من وسط الاستعمار أو من وسط الصيانة. هذا النظام المائي مرنة جدا، مما يسمح الظروف التجريبية والضغوط المطبقة ليتم تغييرها بسهولة اعتمادا على مصالح الباحثين.

هذه الطريقة الموصوفة مهمة في سياق مجموعة أكبر من المؤلفات حول التفاعلات النباتية والميكروب لأنه يوفر نظام قوي لدراسة هذه التفاعلات على سطح الجذر في حين يجري أيضا للتخصيص لتفضيلات النمو من بكتيريا مختلفة. مختبرات البيولوجيا النباتية في كثير من الأحيان إجراء تجارب الاستعمار النباتات الميكروب على أجار الصلبة، مما يسمح لحركة المسطحة فقط (إذا كان ذلك) من البكتيريا في حين تتطلب أيضا التلاعب المدمرة المحتملة للنباتات خلال النقل اللاحقة. وعلى النقيض من ذلك، فإن مختبرات علم الأحياء الدقيقة أعطت الأولوية في كثير من الأحيان لصحة البكتيريا ضمن تجاربها، على حساب النباتات^14،15. هذه الأولويات المختلفة للمختبرات التي تركز على النبات والميكروبيولوجيا جعلت تاريخيا من الصعب مقارنة النتائج بين هذه المجموعات، لأن كل عادة ما يحسن الظروف التجريبية لتحسين الكائن الحي من الفائدة¹⁵. نظام النمو النباتي العائم الشبكي الموصوف هنا يمنع الغمر النباتي الكامل، وهو ميزة ملحوظة للدراسات السابقة الموجهة نحو علم الأحياء الدقيقة، مع تحسين نمو البكتيريا وبقائها بشكل مؤقت لتسهيل الاستعمار. وهكذا، فإن التقييم الذي نعرضها هنا قد يعالج المخاوف من كل من علماء الأحياء النباتية (حول الإفراط في الترطيب والتلاعب عن طريق اللمس من النبات) مع تلبية معايير علماء الأحياء الدقيقة (السماح لظروف النمو البكتيرية المختلفة ومتعددة التفاعلات الأنواع)7. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون قابلاً للتكيف مع مختلف البكتيريا والنباتات والظروف البيئية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يتم وصف الإعداد التجريبي للوضوح ويستخدم لإنشاء النتائج التمثيلية المضمنة في هذا التقرير ولكن يمكن تعديل الشروط كما هو مطلوب. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات باستخدام معدات الوقاية الشخصية واتباع التريس المؤسسية والاتحادية للسلامة، وفقا لحالة BSL من البكتيريا المستخدمة.

1. توصيف البكتيريا

1. تحديد مورفولوجيا البكتيريا على لوحة أجار متوسطة النمو. إعادة تعليق الخلايا في OD_{تقريبي 600} = 0.5 ولوحة حجم 1 μL على أجار المتوسطة للاختيار. إضافة X-غال إلى لوحات أجار إلى التركيز النهائي من 20 ملغ / مل للتمييز بشكل أفضل أفراد الفردية من المجتمع البكتيري محددة. تنمو في 24 درجة مئوية أو 30 درجة مئوية حتى تشكل المستعمرات، ثم التقاط الصور والملاحظات على مورفولوجيا المستعمرة.
2. تحديد العلاقة بين الكثافة البصرية لكل سلالة بكتيرية وعدد CFU (وحدات تشكيل مستعمرة) لكل مل^16. إعادة تعليق البكتيريا في 1 مل من الماء في لوحة 24 جيدا إلى OD تقريبي₆₀₀ = 5، وأداء تخفيفات تسلسلية مزدوجة، ورصد OD₆₀₀ من جميع التخفيفات، ولوحة كل لتحديد CFU قابلة للحياة / مل في كل عينة في كثافات بصرية متعددة.
3. تحديد الحد الأقصى للتسامح سونيكيشن لكل سلالة البكتيرية. للقيام بذلك، خلايا aliquot في لوحة 24 جيدا تحتوي على وسط السائل، وحجز بعض الخلايا كعينة تحكم غير سونيكونت. باستخدام ultrasonicator مع مرفق القرن 24 غيض، وتطبيق ثلاث جولات من 12 ق من سونيكيشن في 40 أمبير مع 2 ق البقول.
   ملاحظة: ينصح باستخدام ultrasonicator 24-well لتسهيل تعدد الإرسال المصب من عينات مصنع تجهيز، ولكن إذا كان أحد غير متوفر، واستخدام ultrasonicator مزودة microtip وأداء كل sonication عينة بشكل مستقل. دائما ارتداء earmuffs تصنيفها إلى ما لا يقل عن 25 NRR الحماية.
4. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف للعينات الصوتية وغير الصوتية وبقعة على لوحات أجار. تحديد ما إذا كان هناك انخفاض في الخلايا القابلة للحياة بعد sonication. إذا كان الأمر كذلك، واستخدام عينة جديدة وتكرار خطوة sonication باستخدام انخفاض إجمالي وقت sonication أو السعة حتى العلاج ليس له تأثير على CFU النهائي / مل¹⁷.

2. إعداد شتلات التلايا العربية على شبكة بلاستيكية

1. إنشاء أقراص من شبكة بلاستيكية باستخدام اللكم ثقب القياسية.
   1. جمع الأقراص في وعاء زجاجي مع غطاء فضفاض من رقائق الألومنيوم، وتعقيم باستخدام الأوتوكلاف تعيين إلى دورة جافة 20 دقيقة^13.
   2. باستخدام ملاقط معقمة اللهب، توزيع ما يقرب من 40 أقراص شبكة معقمة في طبقة واحدة عبر سطح نبات النمو المتوسطة لوحة أجار. استخدام 0.5x موراشيج وسكوغ (MS) الأملاح، التي تحتوي على 500 ملغ / لتر من MES العازلة [2-(N-morpholino)حمض الإيثانسولفونيك] و 1.5٪ باكتو أجار، كوسيلة لنمو النبات، مع 50 ميكروغرام / مل بينوميليل وأضاف إلى الحد التلوث الفطري من الشتلات.
2. إعداد بذور الفأس من A. thaliana كما سبق وصفها¹⁷.
   1. ضع ما يقرب من 100-300 بذور في كل منها في أنابيب الطرد المركزي الفردية في رف ووضعها في زجاج قابل لإعادة الإغلاق أو حاوية بلاستيكية ثقيلة ("جرة") في غطاء الدخان.
   2. توخي الحذر، وضع كوب من 100 مل من التبييض في جرة، إضافة 3 مل من حمض الهيدروكلوريك المركزة إلى التبييض، وختم على الفور جرة والسماح للأبخرة لتعقيم البذور لمدة 4 ساعة على الأقل.
   3. إزالة بعناية أنابيب البذور المعقمة من تحت جرة وختم.
3. وضع اثنين من البذور في وسط كل شبكة. ختم لوحات مع الشريط الجراحي وحضانة لمدة 2-6 أيام في 4 درجة مئوية في الظلام لvernalize البذور.
4. لإنبات الشتلات وزراعتها، ضع جانب أجار اللوحة في غرفة نمو النبات لمدة 8-10 أيام تحت إعدادات اليوم القصير: 9 ساعة من الضوء عند 21 درجة مئوية و15 ساعة من الظلام عند 18 درجة مئوية (الشكل1، الخطوة 2).

3. استعمار النباتات في متوسط النمو البكتيري السائل

1. أضف 1 مل من النمو البكتيري إلى كل بئر من طبق معقم 24 بئر، باستثناء آبار التحكم الخاصة بوسائط الإعلام فقط. استخدام لينوكس لوريا مرق (10 غرام من التربتون، 5 غرام من مستخلص الخميرة، 5 غرام من NaCl) كوسيلة النمو البكتيري.
2. نقل الشتلات الإنبات جزءا لا يتجزأ من شبكة من لوحات أجار إلى السائل (الشكل1، الخطوة 3أ).
   1. قشر بلطف شبكة تحتوي على اثنين من الشتلات الإنبات صعودا وقبالة لوحة أجار باستخدام ملقط اللهب المعقمة. اختيار شبكة مع الشتلات الحجم على قدم المساواة وغير التالفة.
   2. إذا كان الإزالة من أجار ليست على نحو سلس، وتجاهل تلك الشبكة والنبات. نقل تعويم واحد إلى كل بئر من السائل نمو البكتيرية، والجذر الجانب إلى أسفل.
3. تلقيح البكتيريا في الآبار التي تحتوي على الشتلات العائمة.
   1. إعادة تعليق البكتيريا المزروعة بين عشية وضحاها على لوحات أجار إلى OD₆₀₀ ما يعادل 10⁸ كفو / مل في السائل المتوسط النمو البكتيري. إضافة 10 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى كل بئر للتركيز النهائي من 10⁶ CFU البكتيريا في بئر.
   2. إذا إعداد مزيج من البكتيريا، وإعادة تعليق كل إلى OD₆₀₀ ما يعادل 10⁸ CFU / مل، ومزيج بنسب متساوية، وإضافة 10 ميكرولتر من المزيج النهائي لكل بئر من السائل.
4. ختم لوحة للنمو المعقم. دون لمس الجانب لزجة، اضغط بعناية على الفيلم الغاز نفاذية عبر لوحة. تأكد من أن كل بئر قد تم ختمها بشكل فردي من خلال الضغط حول كل من الحلقات التي أدلى بها الآبار. استبدال غطاء من البلاستيك لوحة snuggly على لوحة والفيلم الغاز نفاذية (الشكل1، الخطوة 3b).
5. احتضان لوحات لمدة 18 ساعة في غرفة نمو النبات، في ظل نفس الظروف كما تم إنبات الشتلات في الأصل، إلا على لوحة المدارية شاكر تعيين إلى 220 دورة في الدقيقة.

4- الحفاظ على الاستعمار البكتيري

1. لشطف جميع العوامات (النباتات على شبكة)، إضافة 1 مل من الماء المعقم إلى الآبار من لوحة جديدة 24 جيدا. إزالة فيلم الغاز نفاذية. باستخدام ملقط معقمة، نقل العوامات إلى الآبار مع الماء (الشكل1، الخطوة 4أ). شطف عن طريق يستريح لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون إثارة.
   ملاحظة: لتحديد كفاءة الاستعمار البكتيري للجذور بدلا ً من قدرتها على الحفاظ على الاستعمار مع مرور الوقت، يمكن التضحية بالنباتات في هذه الخطوة عن طريق نقلها مباشرة إلى الخطوة 5.1.
2. ملء الآبار من لوحة جديدة 24 جيدا مع 1 مل من متوسط نمو النبات. نقل شبكة واحدة إلى كل بئر. تغطية مع ختم الغاز نفاذية وحضانة لمدة 72 ساعة على شاكر لوحة المدارية في 220 دورة في الدقيقة في غرفة نمو النبات (الشكل1، الخطوة 4ب).
3. كرر الفرّة كما تم تنفيذها في الخطوة 4.1 مع العوامات بعد فترة الحضانة 72 ساعة.

5. جمع البكتيريا لأعداد الخلايا القابلة للحياة

ملاحظة: يمكن تحديد عدد البكتيريا لكل جذر الشتلات في أي نقطة زمنية الحضانة. يمكن رصد الاستعمار بين 0 ساعة و 18 ساعة، في حين يمكن رصد الصيانة من 18 ساعة فصاعدا. ويمكن للنباتات الموجهة للتصوير أن تنتقل مباشرة إلى القسم 6.

1. إزالة الشتلات من شبكة (الشكل1، الخطوة 5). وضع بلطف الملقط معقمة اللهب تحت الأوراق (ولكن على الجانب ورقة من شبكة)، وقرصة طفيفة الجذعية. هز الشتلات صعودا وبعيدا عن شبكة لطرد الجذر دون كسره. إذا كسر الجذر، كشط بلطف أسفل شبكة لجمع طول كامل.
2. إزالة البكتيريا من جذور النبات. نقل البكتيريا إلى الآبار من لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من ddH₂0. Sonicate العينات كما هو موضح في الخطوة 1.3.
   ملاحظة: باستخدام المجهر، ابحث عن أي بكتيريا المتبقية على سطح الجذر على عينة سونيكاتد. إذا بقيت البكتيريا، قم بزيادة الوقت أو الكثافة الصوتية الإجمالية حتى لا تبقى البكتيريا مقيدة، حتى أعلى مستوى من سونيكيشن التي لا تؤثر على عدد الخلايا القابلة للحياة على النحو المحدد في القسم 1.
3. قياس البكتيريا على الجذور.
   1. تنفيذ تخفيف المسلسل 10 أضعاف العينات sonicated تصل إلى 10-6 تخفيف في المتوسطة النمو البكتيري. إضافة 50 درجة مئوية من كل تخفيف للوحات أجار الفردية وتنتشر مع الخرز الزجاجي المعقم (أو المفرش البكتيري). احتضان لوحات في درجة الحرارة المثلى للبكتيريا حتى المستعمرات الفردية يمكن عدها.
   2. مرة واحدة يمكن تمييزها، عد عدد كل مورفولوجيا مستعمرة (على النحو المحدد في القسم 1)، وحساب CFU من كل الأنواع البكتيرية لكل شتلة. تجاهل أي عينات تظهر التلوث، لأن التلوث أثناء الاستعمار أو الصيانة قد يؤثر على الوجود البكتيري.

6. جمع جذور النباتات سليمة للميكروسكوب

1. باستخدام ملقط، قم بإزالة الشتلات من الشبكة كما هو الحال في القسم 5.
2. نقل كل مصنع إلى الشرائح المجهر.
   1. ضع طرف الجذر على الشريحة واسحب بعيدا ً عن الطرف لتعيين الدفق مع الشريحة، مما يضمن وجود جذر مستقيم للحصول على أفضل تصوير. إضافة قطرة من الماء أو نمو النبات المعقمة المتوسطة إلى العينات لترطيب واجهات بين الأغطية والشرائح.
   2. ضع غطاء زجاجي فوق تاج الجذر مباشرة (أعلى منطقة محاصرة في الشكل1) وتحت أوراق التصوير لتجنب الميل من غطاء الغلاف (للسماح للتصوير تاج الجذر)، واضغط لأسفل بلطف¹⁷.
3. إذا كنت تستخدم البكتيريا الفلورية، صورة باستخدام مرشحات الإثارة / الانبعاثات المناسبة للتمييز بين البكتيريا عن بعضها البعض وجذر النبات^18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ومن المعروف أن PGPB P. simiae WCS417r تتميز جيدا لاستعمار جذور A. thaliana في الثقافة المائية. ويمكن بسهولة تصور هذه البكتيريا الفلورية الطبيعية باستخدام المجهر على جذورالشتلات بعد الاستعمار (الشكل 2). على الرغم من أنه من الممكن تصوير الطول الكامل لهذه الجذور ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

النباتات في جميع البيئات تتفاعل مع الآلاف إلى الملايين من البكتيريا المختلفة والفطريات^5،7. ويمكن لهذه التفاعلات أن تؤثر سلبا وإيجابا على صحة النبات، مع ما قد يترتب على ذلك من آثار على غلة المحاصيل وإنتاج الأغذية. ويشير العمل الأخير أيضاً إلى أن الاستعمار ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017