Monitoraggio della colonizzazione e della manutenzione batterica sull'Arabidopsis thaliana Radici in un sistema idroponico galleggiante

Riepilogo

Qui descriviamo un test di crescita delle piante idroponica per quantificare la presenza delle specie e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il loro trasferimento in diversi ambienti di crescita.

Abstract

I batteri formano microbiomi di rizosfera complessi modellati da microbi interagenti, organismi più grandi e l'ambiente abiotico. In condizioni di laboratorio, la colonizzazione della rizosfera da batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB) può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti rispetto alle piante non colonizzate. Tuttavia, nelle impostazioni di campo, i trattamenti batterici con PGPB spesso non forniscono benefici sostanziali alle colture. Una spiegazione è che questo può essere dovuto alla perdita del PGPB durante le interazioni con microbi del suolo endogeni durante la durata della vita della pianta. Questa possibilità è stata difficile da confermare, dal momento che la maggior parte degli studi si concentra noto sulla colonizzazione iniziale piuttosto che sul mantenimento del PGPB all'interno delle comunità di rizosfera. Si ipotizza qui che l'assemblaggio, la coesistenza e il mantenimento delle comunità batteriche siano modellati da caratteristiche deterministiche del microambiente di rizosfera, e che queste interazioni possano influenzare la sopravvivenza di PGPB in ambienti nativi. Per studiare questi comportamenti, un saggio idroponico della crescita vegetale è ottimizzato utilizzando l'Arabidopsis thaliana per quantificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il trasferimento a una crescita diversa Ambienti. La riproducibilità e l'utilità di questo sistema vengono quindi convalidate con la ben studiata PGPB Pseudomonas simiae. Per studiare come la presenza di più specie batteriche può influenzare la colonizzazione e la dinamica di manutenzione sulla radice della pianta, una comunità modello da tre ceppi batterici (un Arthrobacter, Curtobacterium, e Microbacterium specie) originariamente isolata dalla rizosfera A. thaliana. È dimostrato che la presenza di queste diverse specie batteriche può essere misurata utilizzando questo saggio idroponico di pianta-maintanence, che fornisce un'alternativa agli studi della comunità batterica basata sul sequenziamento. Studi futuri che utilizzano questo sistema possono migliorare la comprensione del comportamento batterico nei microbiomi vegetali multispecie nel tempo e nelle mutevoli condizioni ambientali.

Introduzione

La distruzione delle colture da malattie batteriche e fungine comporta una riduzione della produzione alimentare e può interrompere gravemente la stabilità globale¹. Sulla base della scoperta che i microbi nei suoli soppressivi sono responsabili dell'aumento della salute delle piante^2,gli scienziati hanno chiesto se il microbioma vegetale possa essere sfruttato per sostenere la crescita delle piante modificando la presenza e l'abbondanza di particolari specie batteriche³. I batteri trovati per aiutare nella crescita o nello sviluppo delle piante sono collettivamente rilegati ai batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB). Più recentemente, gli studi sono passati dalla semplice identificazione di potenziali PGPB alla comprensione di come le interazioni interkingdome nel suolo, intorno alle radici o nella rizosfera (l'area che circonda direttamente e comprende la superficie della radice) possono avere un impatto pgPB attività⁴.

La colonizzazione della rizosfera da parte del PGPB può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti in risposta a diversi fattori di stress rispetto alle piante non colonizzate⁵. Tuttavia, i risultati sono spesso più variabili nelle condizioni del suolo nativo rispetto a quelli osservati nelle impostazioni strettamente controllate della serra e del laboratorio⁶. Un'ipotesi per questa differenza è che la crescita o il comportamento di PGPB può essere inibito da batteri del suolo nativo o funghi nei campi^7,8. Gli effetti benefici dei batteri di rizosfera dipendono generalmente dalla capacità dei batteri a 1) individuare e spostarsi verso la radice, 2) colonizzare la radice attraverso la formazione di biofilm e 3) interagire con la pianta o gli agenti patogeni ospiti attraverso la produzione di piccole molecole metaboliti^7,9. Ognuno di questi comportamenti di colonizzazione può essere influenzato dalla presenza e dall'attività dei microbi vicini¹⁰.

Abbiamo progettato un sistema per quantificare e visualizzare queste distinte fasi di colonizzazione batterica della rizosfera (Figura 1). Questo approccio faciliterà gli studi sul motivo per cui la manutenzione PGPB a lungo termine non viene talvolta osservata dopo il trasferimento di piante in nuovi ambienti, ad esempio durante la semina di piantine pre-inocupate. Arabidopsis thaliana come sono stati scelti come un modello vegetale a causa del suo ampio uso in studi di laboratorio, nonché gli ampi dati disponibili sulle sue interazioni microbiche¹¹. Ci sono tre fasi nel sistema: 1) A. thaliana crescita, 2) colonizzazione batterica, e 3) la manutenzione batterica (vedi Figura 1). Poiché A. thaliana è una pianta terrestre, era importante assicurarsi che non soffrisse indebitamente lo stress idrico nel sistema idroponico¹². Ispirate ai metodi utilizzati da Haney et al.¹³, le piantine vengono coltivate su rete di plastica per separare il tiro dal mezzo di crescita liquido. Questo sistema non sembra compromettere la salute e lo sviluppo dell'ospite della pianta, e migliora la crescita di A. thaliana nel liquido¹¹. Come il germoglio pianta galleggia sopra la superficie, le radici sono completamente esposti alla colonizzazione da batteri inoculati nel mezzo di crescita batterica liquida. Questo permette ai batteri di interesse di essere esaminati per la colonizzazione in sostanze nutritive che sono più favorevoli alla crescita, mentre poi spostando le condizioni per consentire alla pianta di continuare a crescere in un mezzo nutritivo progettato per sostenere la sua crescita. Entrambe le fasi includono agitazione costante per prevenire l'anossia della radice¹³. I batteri possono essere visualizzati o quantificati dalle radici delle piante dopo il trasferimento dal mezzo di colonizzazione o dal mezzo di manutenzione. Questo sistema idroponico è molto flessibile, consentendo di modificare facilmente le condizioni sperimentali e le sollecitazioni applicate a seconda degli interessi dei ricercatori.

Questo metodo descritto è importante nel contesto della più ampia letteratura sulle interazioni pianta-microbo perché fornisce un sistema robusto per studiare queste interazioni sulla superficie della radice, pur essendo personalizzabile alle preferenze di crescita di batteri diversi. I laboratori di biologia vegetale spesso eseguono esperimenti di colonizzazione pianta-microbo su agar solido, consentendo solo il movimento planare (se questo) di batteri, richiedendo anche la manipolazione potenzialmente distruttiva delle piante durante il successivo trasferimento. Al contrario, i laboratori di microbiologia hanno spesso dato priorità alla salute dei batteri all'interno dei loro esperimenti, a scapito delle piante^14,15. Queste diverse priorità dei laboratori incentrati sulle piante e la microbiologia hanno storicamente reso storicamente difficile confrontare i risultati tra questi gruppi, poiché ognuno in genere ottimizza le condizioni sperimentali per ottimizzare il loro organismo di interesse¹⁵. Il sistema di crescita delle piante a maglie galleggianti descritto qui previene l'immersione totale delle piante, un notevole vantaggio per i precedenti studi orientati alla microbiologia, ottimizzando anche temporaneamente la crescita e la sopravvivenza dei batteri per facilitare la colonizzazione. Così, il test che presentiamo qui può affrontare le preoccupazioni sia dei biologi delle piante (circa l'eccessiva idratazione e la manipolazione tattile della pianta) soddisfacendo i criteri dei microbiologi (consentendo diverse condizioni di crescita batterica e molteplici interazioni delle specie)⁷. Questo protocollo è progettato per essere adattabile per l'uso con vari batteri, piante e condizioni ambientali.

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Protocollo

NOTA: la configurazione sperimentale viene descritta per chiarezza e utilizzata per generare i risultati rappresentativi inclusi in questo report, ma le condizioni possono essere modificate come desiderato. Tutte le misure devono essere eseguite utilizzando PPE e seguendo le ricattie istituzionali e federali per la sicurezza, secondo lo stato BSL dei batteri utilizzati.

1. Caratterizzazione dei batteri

1. Determinare la morfologia dei batteri sulla piastra di agar medio di crescita. Risospendere le celle a un valore approssimativo Di OD₆₀₀ - 0,5 e placcare un volume di 1 ll sul mezzo di agar di scelta. Aggiungere X-gal alle piastre di agar ad una concentrazione finale di 20 mg/mL per differenziare meglio i singoli membri della specifica comunità batterica. Coltivare a 24 o 30 gradi centigradi fino a formare colonie, quindi scattare foto e note sulla morfologia della colonia.
2. Definire la correlazione tra la densità ottica di ogni ceppo batterico e il numero di CFU (unità formanti colonia) per mL¹⁶. Risospendere i batteri in 1 mL di acqua in una piastra di 24 pozze a un approssimativo OD₆₀₀ x 5, eseguire diluizioni seriali bi-piegate, monitorare OD₆₀₀ di tutte le diluizioni e piastra ciascuna per determinare la CFU/mL praticabile in ogni campione a più densità ottiche.
3. Determinare la tolleranza massima di sonicazione per ogni ceppo batterico. Per fare questo, aliquota cellule in una piastra 24-po 'contenente mezzo liquido, riservando alcune cellule come un campione di controllo non sonoro. Utilizzando un ultrasonicatore con un attacco a clacson a 24 punta, applicare tre giri di sonicazione a 40 amplificatore con impulsi 2 s.
   NOTA: Si consiglia l'uso di un ultrasonica 24-well per facilitare il multiplexing a valle dei campioni dell'impianto di lavorazione, ma se non disponibile, utilizzare un ultrasonicatore dotato di un microtip ed eseguire ogni sonicazione campione in modo indipendente. Indossare sempre le braccia con classificazione ad almeno 25 protezione NRR.
4. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte dei campioni sonicati e non sonicati e individuare sulle piastre di agar. Determinare se c'è una riduzione delle cellule vitali dopo la sonicazione. In tal caso, utilizzare un campione fresco e ripetere la fase di sonicazione utilizzando un tempo di sonicazione totale ridotto o un'ampiezza fino a quando il trattamento non ha alcun effetto sulla finale CFU/mL¹⁷.

2. Preparazione delle piantine di talidopsis thaliana su una rete di plastica

1. Creare dischi della rete di plastica utilizzando un perforatore standard.
   1. Raccogliere i dischi in un contenitore di vetro con una copertura sciolta di foglio di alluminio, e sterilizzare utilizzando un autoclave impostato su un ciclo secco 20 min¹³.
   2. Utilizzando pinzette sterilizzate a fiamma, distribuire circa 40 dischi mesh sterilizzati in un unico strato sulla superficie di una piastra di agar medio-crescita vegetale. Utilizzare 0,5 x sali di Murashige e Skoog (MS), contenenti 500 mg/l di MES buffer [2-(N-morpholino)ethanesulnic acid] e 1.5% Bacto agar, come mezzo di crescita vegetale, con 50 g/mL benomyl aggiunti al limite di contaminazione fungina delle piantine.
2. Preparare i semi axenic di A. thaliana come descritto in precedenza¹⁷.
   1. Mettere circa 100-300 semi ciascuno in singoli tubi di centrifuga in un rack e metterli in un vetro rissigillo o contenitore di plastica pesante ("jar") in un cappuccio fume.
   2. Con cautela, mettere un becher di 100 mL di candeggina nel barattolo, aggiungere 3 mL di HCl concentrato alla candeggina, e sigillare immediatamente il barattolo e consentire ai fumi di sterilizzare i semi per almeno 4 h.
   3. Rimuovere con attenzione i tubi di semi sterilizzati da sotto il vaso e sigillare.
3. Posizionare due semi al centro di ogni mesh. Sigillare le lastre con nastro chirurgico e incubare per 2-6 giorni a 4 gradi centigradi al buio per vernalizzare i semi.
4. Per germinare e coltivare piantine, posizionare il lato del piatto in una camera di crescita della pianta per 8-10 giorni in brevi impostazioni di giorno: 9 h di luce a 21 gradi centigradi e 15 h di scuro a 18 gradi centigradi (Figura1, passo 2).

3. Colonizzazione delle piante nel mezzo di crescita batterica liquida

1. Aggiungere 1 mL di mezzo di crescita batterica a ogni pozzo di una piastra sterile da 24 pozze, fatta eccezione per i pozzi di controllo solo dei media. Utilizzare Lennox Luria Brodo (10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl) come mezzo di crescita batterica.
2. Trasferire le piantine germinate incorporate nella rete dalle piastre di agar al liquido (Figura 1, passo 3a).
   1. Sbucciare delicatamente la rete contenente due piantine germinarate su e giù per la piastra di agar utilizzando pinze sterilizzate dalla fiamma. Scegliere mesh con piantine di dimensioni uguali e non danneggiate.
   2. Se la rimozione dall'agar non è liscia, scartare quella rete e pianta. Trasferire un galleggiante ad ogni pozzo di liquido di crescita batterica, lato radice verso il basso.
3. Inoculare i batteri in pozzi contenenti piantine galleggianti.
   1. Risospendere i batteri coltivati durante la notte su piastre di agar a un OD₆₀₀ equivalente a 10⁸ CFU/mL nel liquido medio di crescita batterica. Aggiungete 10 gradi di sospensione batterica ad ogni pozzo per una concentrazione finale di 10⁶ batteri CFU per pozzo.
   2. Se si prepara un mix di batteri, risospendere ciascuno all'OD₆₀₀ equivalente a 10⁸ CFU/mL, mescolare in proporzioni uguali e aggiungere 10 l del mix finale per pozzo di liquido.
4. Sigillare la piastra per una crescita sterile. Senza toccare il lato appiccicoso, premere con attenzione la pellicola permeabile a gas attraverso la piastra. Assicurarsi che ogni pozzo sia stato sigillato individualmente applicando pressione intorno a ciascuno degli anelli realizzati dai pozze. Sostituire il coperchio di plastica della piastra sopra la piastra e la pellicola permeabile al gas (Figura1, step 3b).
5. Incubare le piastre per 18 h in una camera di crescita vegetale, nelle stesse condizioni in cui le piantine sono state originariamente germinate, ad eccezione di uno shaker di placche orbitali impostato a 220 rpm.

4. Manutenzione della colonizzazione batterica

1. Per sciacquare tutti i galleggianti (piante su rete), aggiungere 1 mL di acqua sterile ai pozzi di una nuova piastra di 24 pozze. Rimuovere la pellicola permeabile al gas. Utilizzando pinze sterili, trasferimento galleggia su pozzi con acqua (Figura1, passo 4a). Risciacquare riposando per 10 min a temperatura ambiente (RT) senza agitazione.
   NOTA: Per determinare l'efficienza di colonizzazione batterica delle radici piuttosto che la loro capacità di mantenere la colonizzazione nel tempo, le piante possono essere sacrificate a questo passaggio portandole direttamente al passo 5.1.
2. Riempire i pozze di una nuova piastra di 24 pozze con 1 mL di mezzo di crescita vegetale. Trasferire una mesh in ogni pozzo. Coprire con una guarnizione a gas permeabile e incubare per 72 h sullo shaker di piastra orbitale a 220 rpm nella camera di crescita delle piante (Figura 1, passo 4b).
3. Ripetere il risciacquo eseguito al punto 4.1 con galleggianti dopo il periodo di incubazione di 72 h.

5. Raccolta di batteri per il numero di cellule vitali

NOTA: Il numero di batteri per radice di piantina può essere determinato in qualsiasi momento di incubazione. La colonizzazione può essere monitorata tra 0 h e 18 h, mentre la manutenzione può essere monitorata da 18 h in poi. Le piante destinate all'imaging possono procedere direttamente alla sezione 6.

1. Rimuovere le piantine dalla rete (Figura1, passaggio 5). Posizionare delicatamente le pinze sterilizzate dalla fiamma sotto le foglie (ma sul lato foglia della rete) e pizzicare leggermente il gambo. Muovi le piantine su e giù dalla rete per spostare la radice senza romperla. Se la radice si rompe, raschiare delicatamente il fondo della maglia per raccogliere l'intera lunghezza.
2. Rimuovere i batteri dalle radici delle piante. Trasferire i batteri in pozze di una piastra di 24 pozze contenenti 1 mL di ddH₂0. Sonicare i campioni come descritto nel passaggio 1.3.
   NOTA: Utilizzando un microscopio, cercare eventuali batteri rimanenti sulla superficie della radice su un campione sonicato. Se i batteri rimangono, aumentare il tempo totale di sonicazione o intensità fino a quando nessun batterio rimane legato, fino al più alto livello di sonicazione che non influisce sui conteggi delle cellule vitali come determinato nel paragrafo 1.
3. Quantificare i batteri sulle radici.
   1. Eseguire diluizioni seriali di 10 volte dei campioni sonicati fino a una diluizione 10^-6 nel mezzo di crescita batterica. Aggiungere 50 l di ogni diluizione a singoli placchi di agar e spalmati con perline di vetro sterili (o spalmatore batterico). Incubapi alla temperatura ottimale per i batteri fino a quando le singole colonie non sono numerabili.
   2. Una volta distinguibile, contare il numero di morfologia di ogni colonia (come determinato nella sezione 1), e calcolare la CFU di ogni specie batterica per piantità. Eliminare eventuali campioni che mostrano contaminazione, poiché la contaminazione durante la colonizzazione o la manutenzione può influire sulla presenza batterica.

6. Raccolta di radici vegetali intatte per la microscopia

1. Utilizzando le pinze, rimuovere le piantine dalla mesh come nella sezione 5.
2. Trasferire ogni pianta a vetrini al microscopio.
   1. Posizionare la punta della radice sulla diapositiva e trascinare lontano dalla punta per impostare l'abbattimento a filo con la diapositiva, assicurando una radice raddrizzato per la migliore immagine. Aggiungere una goccia d'acqua o un mezzo sterile di crescita delle piante ai campioni per idratare le interfacce tra i copricopertine e i vetrini.
   2. Posizionare una vetrina di vetro appena sopra la corona principale (regione in scatola superiore in Figura 1) e sotto le foglie di tiro per evitare di oltrarsi del coperchio (per consentire l'imaging della corona radice), e premere delicatamente¹⁷.
3. Se si utilizzano batteri fluorescenti, immagine utilizzando appropriati filtri di eccitazione/emissione per differenziare i batteri l'uno dall'altro e la radice della pianta¹⁸.

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Risultati

Il ben caratterizzato PGPB P. simiae WCS417r è noto per colonizzare le radici di A. thaliana nella cultura idroponica. Questo batterio naturalmente fluorescente può essere facilmente visualizzato utilizzando la microscopia sulle radici delle piantine dopo la colonizzazione (Figura 2). Anche se è possibile immaginare l'intera lunghezza di queste radici di a. thaliana (lunghezza 4-6 mm), farlo per molte piante richiederebbe una qua...

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Discussione

Le piante in tutti gli ambienti interagiscono con migliaia a milioni di diversi batteri e funghi^5,7. Queste interazioni possono avere un impatto negativo e positivo sulla salute delle piante, con potenziali effetti sulla resa delle colture e sulla produzione alimentare. Lavori recenti suggeriscono anche che la colonizzazione variabile delle colture da parte dei PGPB può spiegare le dimensioni imprevedibili delle piante e la resa delle colture nelle prove sul cam...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017