Мониторинг бактериальной колонизации и технического обслуживания на арабидопсис thaliana Корни в плавающей гидропонной системы

Резюме

Здесь мы описываем гидропонный план роста исследования для количественной оценки присутствия видов и визуализации пространственного распределения бактерий во время первоначальной колонизации корней растений и после их передачи в различных средах роста.

Аннотация

Бактерии образуют сложные микрофлоры корневища, сформированные взаимомикробами, взаимодействующими, более крупными организмами и абиотической средой. В лабораторных условиях, порочносферная колонизация бактериями, стимулирующими рост растений (PGPB), может повысить здоровье или развитие растений-хозяев по сравнению с неколонизованных растений. Однако, в полевых условиях, бактериальные процедуры с PGPB часто не обеспечивают существенных преимуществ для сельскохозяйственных культур. Одно из объяснений заключается в том, что это может быть связано с потерей PGPB во время взаимодействия с эндогенными микробами почвы в течение срока службы растения. Эту возможность было трудно подтвердить, так как большинство исследований сосредоточены на первоначальной колонизации, а не поддержание PGPB в rhizosphere общин. Здесь предполагается, что сборка, сосуществование и поддержание бактериальных сообществ определяются детерминированными особенностями микросреды ризосферы, и что эти взаимодействия могут повлиять на выживание PGPB в родных местах. Для изучения такого поведения, гидропонный план роста анализа оптимизирован с помощью Arabidopsis thaliana количественно и визуализировать пространственное распределение бактерий во время первоначальной колонизации корней растений и после перехода к различным ростам Средах. Воспроизводимость и полезность этой системы затем проверяются с хорошо изученным PGPB Pseudomonas simiae. Чтобы исследовать, как наличие нескольких видов бактерий может повлиять на колонизацию и динамику обслуживания на корне растения, модель сообщества из трех бактериальных штаммов (Артробактерия, Куртобактерии, и Microbacterium , и Microbacterium видов) первоначально изолированы от A. thaliana rhizosphere построен. Показано, что присутствие этих разнообразных бактериальных видов может быть измерено с помощью этого гидропонного исследования растительного языка, который обеспечивает альтернативу секвенирования основе бактериальных исследований сообщества. Будущие исследования с использованием этой системы могут улучшить понимание бактериального поведения в многовидовых микробиомах растений с течением времени и в меняющихся условиях окружающей среды.

Введение

Уничтожение сельскохозяйственных культур бактериальными и грибковыми заболеваниями приводит к снижению производства продуктов питания и может серьезно нарушить глобальную стабильность¹. Основываясь на открытии, что микробы в подавляющих почвах несут ответственность за повышение здоровья растений², ученые спросили, может ли микробиом растений быть использованы для поддержки роста растений путем изменения присутствия и изобилия частности бактериальных видов³. Бактерии, найденные для помощи в росте растений или развитии, коллективно называются бактериями, способствующими росту растений (PGPB). В последнее время исследования перешли от простого выявления потенциальных PGPB к пониманию того, как взаимодействие между царством в почве, вокруг корней, или в rhizosphere (область, непосредственно окружающая и в ключая корневую поверхность) может влиять на PGPB деятельность⁴.

Колонизация rhizosphere PGPB может увеличить здоровье или развитие растений хозяина в ответ на различные стрессоры по отношению к неколонизованных растений⁵. Однако, результаты часто более переменны в родных условиях почвы посравнению с теми, которые наблюдаются в тесно контролируемых тепличных и лабораторных условиях 6. Одна из гипотез для этого различия заключается в том, что рост или поведение PGPB может быть ингибирована родной почвенных бактерий или грибов в полях^7,8. Благотворное воздействие rhizosphere бактерий обычно зависит от способности бактерий 1) найти и двигаться к корню, 2) колонизировать корень через биопленки формирования, и 3) взаимодействовать с принимающей растений или патогенов через производство малых молекул метаболитов^7,9. Любое из этих колонизации поведения могут быть затронуты наличием и активностью соседних микробов¹⁰.

Мы разработали систему количественной оценки и визуализации этих различных этапов бактериальной колонизации ризосферы(рисунок 1). Этот подход облегчит исследования, исследующие, почему долгосрочное техническое обслуживание PGPB иногда не наблюдается после переноса растений в новые среды, например, во время посадки предварительно привитых саженцев. Arabidopsis thaliana, как были выбраны в качестве модели растений из-за его широкого использования в лабораторных исследованиях, а также достаточно данных о его микробных взаимодействий¹¹. Есть три этапа в системе: 1. A. thaliana роста, 2) бактериальной колонизации, и 3) бактериального обслуживания (см. Рисунок 1). Поскольку А. Талиана является наземным растением, было важно, чтобы он не страдал неоправданным водным стрессом в гидропонной системе¹². Вдохновленные методами, используемыми Haney et al.^13,саженцы выращиваются на пластиковой сетке, чтобы отделить побег от жидкой среды роста. Эта система, как представляется, не ставит под угрозу здоровье и развитие хозяина растения, и это улучшает рост A. thaliana в жидкости¹¹. Как завод стрелять плавает над поверхностью, корни полностью подвержены колонизации бактериями прививки в жидкой бактериальной среды роста. Это позволяет бактерии, представляющие интерес, которые будут рассмотрены для колонизации питательных веществ, которые являются наиболее благоприятными для роста, в то время как изменение условий, чтобы позволить заводу продолжать расти в питательной среде, предназначенной для поддержки его роста. Оба этапа включают устойчивое встряхивание, чтобы предотвратить аноксию корня¹³. Бактерии могут быть визуализированы или количественно из корней растений после передачи либо из колонизации среды или поддержания среды. Эта гидропоника очень гибкая, что позволяет легко изменять экспериментальные условия и прикладные напряжения в зависимости от интересов исследователей.

Этот описанный метод имеет важное значение в контексте более широкого тела литературы о растительно-микробных взаимодействий, поскольку он обеспечивает надежную систему для изучения этих взаимодействий на корневой поверхности, а также настраиваемый на предпочтения роста различных бактерий. Лаборатории биологии растений часто выполняют эксперименты по колонизации растений и микробов на твердом агаре, что позволяет проводить только планарное движение (если это) бактерий, требуя при этом потенциально разрушительных манипуляций растений во время последующей передачи. В отличие от микробиологических лабораторий часто приоритеты здоровья бактерий в рамках своих экспериментов, в ущерб растениям^14,15. Эти различные приоритеты растений и микробиологии ориентированных лабораторий исторически затрудняет сравнение результатов между этими группами, так как каждый из них обычно оптимизирует экспериментальные условия для оптимизации их организм интересов¹⁵. Описанная здесь система плавающей сетки растений предотвращает полное погружение растений, что является заметным преимуществом для предыдущих исследований, ориентированных на микробиологию, а также временно оптимизирует рост и выживание бактерий для содействия колонизации. Таким образом, анализ, который мы представляем здесь, может решить проблемы как биологов растений (о чрезмерной гидратации и тактильных манипуляций завода), удовлетворяя при этом критериям микробиологов (с учетом различных условий роста бактерий и нескольких видовых взаимодействий)⁷. Этот протокол предназначен для адаптивной для использования с различными бактериями, растениями и условиями окружающей среды.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная настройка описывается для ясности и используется для генерации репрезентативных результатов, включенных в данный отчет, но условия могут быть изменены по желанию. Все шаги должны быть выполнены с использованием СИЗ и после институциональных и федеральных reccomendations для безопасности, в соответствии с статусом BSL бактерий, используемых.

1. Характеристика бактерий

1. Определите морфологию бактерий на росте средней агарпластинки. Resuspend клетки на приблизительном OD₆₀₀ и 0,5 и пластины 1 йЛ объем на агар среды выбора. Добавьте X-gal к пластинам агара к окончательной концентрации 20 мг/мл, чтобы лучше дифференцировать отдельных членов конкретного бактериального сообщества. Расти при 24 градусах или 30 градусах цельсия до тех пор, пока не образуются колонии, а затем фотографируйте и заметки о морфологии колоний.
2. Определите корреляцию между оптической плотностью каждого бактериального штамма и количеством CFU (колоний формирования единиц) на мл¹⁶. Resuspend бактерий в 1 мл воды в 24-хорошая пластина к приблизительной OD₆₀₀ и 5, выполнять двукратные серийные разбавления, контролировать OD₆₀₀ всех разбавлений, и пластины каждый, чтобы определить жизнеспособный CFU / мл в каждом образце на несколько оптических плотностей.
3. Определите максимальную тонкую тонкую сотовую устойчивость к каждому бактериально-бактериальном штамму. Для этого, аликвотные клетки в 24-ну хорошую пластину, содержащую жидкую среду, резервирование некоторых клеток в качестве незвукового контрольного образца. Используя ультразвуковой с 24-наконечником рога вложения, применять три раунда 12 с s sonication на 40 усилителя с 2 импульсов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 24-хорошо ультразвукового рекомендуется для облегчения вниз по течению мультиплексирования образцов обработки растений, но если один не доступен, использовать ультразвуковой оснащен микротип и выполнять каждый образец sonication самостоятельно. Всегда носите наушники с рейтингом не менее 25 NRR защиты.
4. Выполните 10-кратное серийное разбавление звуковых и незвуковых образцов и напрягайте на агар-пластинах. Определите, есть ли сокращение жизнеспособных клеток после sonication. Если это так, используйте свежий образец и повторить звуковой шаг, используя сокращенное общее время звукования или амплитуды, пока лечение не оказывает влияния на окончательный CFU/mL^17.

2. Приготовление саженцев арабидопсиса талианы на пластиковой сетке

1. Создавайте диски из пластиковой сетки с помощью стандартного перфоратора отверстия.
   1. Соберите диски в стеклянном контейнере с рыхлой крышкой из алюминиевой фольги, и стерилизовать с помощью автоклава набор 20 мин сухой цикл¹³.
   2. Используя стерилизованные пламя пинцеты, распределите около 40 стерилизованных сетных дисков в одном слое по всей поверхности агарной пластины растительного роста и среднего уровня. Используйте 0.5x Мурашиге и Skoog (MS) соли, содержащие 500 мг/л буфера МЧС (N-(N-morpholino)этанесульфоновая кислота» и 1,5% Бакто агар, как среда роста растений, с 50 мкг/мл беномила, добавленного к предельному грибковому загрязнению саженцев.
2. Подготовка топорических семян A. thaliana, как ранее описано¹⁷.
   1. Поместите приблизительно 100-300 семян каждый в отдельные центрифуги труб в стойке и поместите в запечатываемый стеклянный или тяжелый пластиковый контейнер ("банк") в дым овой капот.
   2. Используя осторожность, поместите стакан 100 мл отбеливателя в банку, добавить 3 мл концентрированного HCl к отбеливателю, и немедленно запечатать банку и позволяют паров стерилизовать семена, по крайней мере 4 ч.
   3. Аккуратно удалите трубки стерилизованных семян из-под банки и уплотньте.
3. Поместите два семена в центре каждой сетки. Печать пластин с хирургической лентой и инкубировать в течение 2-6 дней при 4 градусах по Цельсию в темноте, чтобы вперегалозировать семена.
4. Чтобы прорасти и вырастить саженцы, поместите пластины агар стороны вниз в камере роста растений в течение 8-10 дней в короткие настройки дня: 9 ч света при 21 КК и 15 ч темных при 18 C(Рисунок 1, шаг 2).

3. Колонизация растений в жидкой бактериальной среде роста

1. Добавьте 1 мл среды роста бактерий к каждой скважине стерильной 24-лукционистской пластины, за исключением только медиа-контрольных скважин. Используйте Леннокс Лурия Бульон (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl) в качестве среды роста бактерий.
2. Перенесите проросшие саженцы, встроенные в сетку из агарных пластин в жидкость(рисунок 1, шаг 3а).
   1. Аккуратно очистить сетку, содержащую две проросшие саженцы вверх и от агарпластинки с помощью пламени стерилизованных щипцы. Выберите сетку с одинаковой и неповрежденной рассадой.
   2. Если удаление из агара не является гладким, отбросить эту сетку и посадить. Передача одного поплавка к каждому колодцу бактериальной жидкости роста, корневой стороной вниз.
3. Прививать бактерии в колодцы, содержащие плавающие саженцы.
   1. Resuspend бактерий, выращенных на ночь на агар пластины од₆₀₀ эквивалентно 10⁸ CFU/mL в бактериальной рост средней жидкости. Добавьте 10 зЛ бактериальной суспензии к каждой скважине для окончательной концентрации 10⁶ бактерий CFU на скважину.
   2. При подготовке смеси бактерий, приложить каждый к OD₆₀₀ эквивалент 10⁸ CFU/mL, смешать в равных пропорциях, и добавить 10 злификатор апл окончательной смеси на хорошо жидкости.
4. Печать пластины для стерильного роста. Не касаясь липкой стороны, тщательно нажмите газпроницаемой пленкой через пластину. Убедитесь, что каждая скважина была индивидуально запечатана, применяя давление вокруг каждого из колец, сделанных скважинами. Замените пластиковую крышку пластины snuggly над пластиной и газпроницаемой пленкой(Рисунок 1, шаг 3b).
5. Инкубировать пластины на 18 ч в камере роста растения, при тех же условиях, как саженцы были первоначально прорастают, за исключением орбитальной пластины шейкер установлен до 220 об/мин.

4. Поддержание бактериальной колонизации

1. Чтобы промыть все поплавки (растения на сетке), добавьте 1 мл стерильной воды в колодцы новой 24-хорошей пластины. Удалите газопроницаемую пленку. Используя стерильные щипцы, перенесите поплавки в колодцы с водой(рисунок 1, шаг 4а). Промыть, отдыхая в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) без возбуждения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения эффективности бактериальной колонизации корней, а не их способность поддерживать колонизацию с течением времени, растения могут быть принесены в жертву на этом этапе, принимая их непосредственно к шагу 5.1.
2. Заполните скважины новой 24-хорошей пластины 1 мл среды роста растений. Передача одной сетки для каждого колодца. Накройте газопроницаемой уплотнением и инкубировать на 72 ч на вышейке орбитальной пластины при 220 об/мин в камере роста растения(рисунок 1, шаг 4б).
3. Повторите промывку в шаге 4.1 с поплавками после инкубационного периода 72 ч.

5. Сбор бактерий для жизнеспособных клеточных отсчетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество бактерий на корень рассады может быть определено в любой момент инкубации. Колонизация может контролироваться между 0 ч и 18 ч, в то время как техническое обслуживание может контролироваться с 18 ч. Растения, предназначенные для визуализации, могут перейти непосредственно к разделу 6.

1. Удалите саженцы из сетки(рисунок 1, шаг 5). Аккуратно поместите пламя стерилизованные щипцы ниже листьев (но на стороне листа сетки), и слегка щепотку стебля. Wiggle рассады вверх и вдали от сетки, чтобы выбить корень, не нарушая его. Если корень ломается, аккуратно соскребите дно сетки, чтобы собрать полную длину.
2. Удалить бактерии из корней растений. Перенесите бактерии в скважины 24-колодской пластины, содержащей 1 мл дДГ₂0. Снотировать образцы, описанные в шаге 1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя микроскоп, ищите все оставшиеся бактерии на поверхности корня на звуковой образец. Если бактерии остаются, увеличить общее время sonication или интенсивность, пока не бактерии остаются связанными, до самого высокого уровня звуковой, что не влияет на жизнеспособные клетки рассчитывает как определяется в разделе 1.
3. Количественная оценка бактерий на корнях.
   1. Выполните серийные 10-кратные разбавления звуковых образцов до 10^-6 разбавления в среде роста бактерий. Добавьте 50 кл. каждого разбавления в отдельные агарные пластины и распространяем с помощью стерильных стеклянных бусин (или бактериального распределителя). Инкубировать пластины при оптимальной температуре для бактерий, пока отдельные колонии подсчитываются.
   2. После того, как различимы, посчитать количество каждой колонии морфологии (как определено в разделе 1), и вычислить CFU каждого бактериального вида на рассаду. Откажитесь от любых образцов, показывающих загрязнение, так как загрязнение во время колонизации или технического обслуживания может повлиять на присутствие бактерий.

6. Сбор нетронутых корней растений для микроскопии

1. Используя щипцы, снимите саженцы из сетки, как в разделе 5.
2. Перенесите каждое растение на слайды микроскопа.
   1. Поместите кончик корня на слайдик и утащите от кончика, чтобы установить сбивать флеш с слайдом, обеспечивая выпрямленный корень для лучшей визуализации. Добавьте каплю воды или стерильные среды роста растений в образцы для гидратных интерфейсов между крышками и слайдами.
   2. Поместите стеклянный покрывало чуть выше корневой коронки (верхняя область в коробке на рисунке 1) и ниже побега листья, чтобы избежать наклона coverslip (для обеспечения корневой коронки изображения), и нажмите вниз мягко¹⁷.
3. При использовании флуоресцентных бактерий, изображение с использованием соответствующих фильтров возбуждения / выбросов, чтобы дифференцировать бактерии друг от друга и корень растения¹⁸.

Результаты

Хорошо охарактеризованный PGPB P. simiae WCS417r, как известно, колонизирует корни A. thaliana в гидропонной культуре. Это естественно флуоресцентные бактерии могут быть легко визуализированы с помощью микроскопии на корнях саженцев после колонизации (Рисунок...

Обсуждение

Растения во всех средах взаимодействуют с тысячамии миллионами различных бактерий и грибов 5,⁷. Такое взаимодействие может оказать негативное и положительное воздействие на здоровье растений, что может оказать потенциальное воздействие на урожайность ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017