Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Resumen

Aquí describimos un ensayo de crecimiento de plantas hidropónicas para cuantificar la presencia de especies y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de su transferencia a diferentes ambientes de crecimiento.

Resumen

Las bacterias forman microbiomas complejos de rizoesfera según los microbios que interactúan, los organismos más grandes y el entorno abiótico. En condiciones de laboratorio, la colonización de la rizosfera por bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPB) puede aumentar la salud o el desarrollo de plantas anfitrionas en relación con las plantas no colonizadas. Sin embargo, en entornos de campo, los tratamientos bacterianos con PGPB a menudo no proporcionan beneficios sustanciales a los cultivos. Una explicación es que esto puede deberse a la pérdida del PGPB durante las interacciones con microbios del suelo endógenos durante la vida útil de la planta. Esta posibilidad ha sido difícil de confirmar, ya que la mayoría de los estudios se centran en la colonización inicial en lugar del mantenimiento de pgPB dentro de las comunidades rizosferas. Se presume aquí que el montaje, la coexistencia y el mantenimiento de las comunidades bacterianas están moldeados por características deterministas del microambiente de la rizoesfera, y que estas interacciones pueden afectar la supervivencia de PGPB en entornos nativos. Para estudiar estos comportamientos, se optimiza un ensayo hidropónico de crecimiento vegetal utilizando Arabidopsis thaliana para cuantificar y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de la transferencia a un crecimiento diferente Entornos. La reproducibilidad y utilidad de este sistema se validan con el bien estudiado PGPB Pseudomonas simiae. Para investigar cómo la presencia de múltiples especies bacterianas puede afectar a la dinámica de colonización y mantenimiento en la raíz de la planta, una comunidad modelo a partir de tres cepas bacterianas (una Arthrobacter, Curtobacteriumy Microbacterium especies) originalmente aisladas de la rizoesfera A. thaliana. Se ha demostrado que la presencia de estas diversas especies bacterianas se puede medir utilizando este ensayo hidropónico de mantenimiento de plantas, que proporciona una alternativa a los estudios comunitarios bacterianos basados en la secuenciación. Estudios futuros utilizando este sistema pueden mejorar la comprensión del comportamiento bacteriano en microbiomas de plantas multiespecie con el tiempo y en condiciones ambientales cambiantes.

Introducción

La destrucción de cultivos por enfermedades bacterianas y fúngicas da lugar a una menor producción de alimentos y puede perturbar gravemente la estabilidad mundial¹. Sobre la base del descubrimiento de que los microbios en suelos supresores son responsables de aumentar la salud vegetal², los científicos han preguntado si el microbioma vegetal puede ser aprovechado para apoyar el crecimiento de las plantas modificando la presencia y abundancia de particulares especies bacterianas³. Las bacterias que se encuentran para ayudar en el crecimiento o desarrollo de las plantas se denominan colectivamente bacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPB). Más recientemente, los estudios han pasado de identificar simplemente el PGPB potencial a entender cómo las interacciones interkingdom en el suelo, alrededor de las raíces o en la rizosfera (el área que rodea directamente e incluye la superficie de la raíz) pueden estar afectando a PGPB actividad⁴.

La colonización rizosfera por PGPB puede aumentar la salud o el desarrollo de las plantas anfitrionas en respuesta a diversos factores estresantes en relación con las plantas no colonizadas⁵. Sin embargo, los resultados son a menudo más variables en las condiciones del suelo nativo en comparación con los observados en los invernaderos y entornos de laboratorio estrechamente controlados⁶. Una hipótesis para esta diferencia es que el crecimiento o comportamiento de PGPB puede ser inhibido por bacterias o hongos de suelo nativo en los campos^7,8. Los efectos beneficiosos de las bacterias rizosfera generalmente dependen de la capacidad de las bacterias a 1) localizar y moverse hacia la raíz, 2) colonizar la raíz a través de la formación de biopelículas, y 3) interactuar con la planta huésped o patógenos a través de la producción de moléculas pequeñas metabolitos^7,9. Cualquiera de estos comportamientos de colonización puede verse afectado por la presencia y actividad de los microbios vecinos¹⁰.

Diseñamos un sistema para cuantificar y visualizar estas distintasetapas de colonización bacteriana de la rizoesfera (Figura 1). Este enfoque facilitará los estudios que investigan por qué a veces no se observa el mantenimiento a largo plazo de la PGPB después de la transferencia de plantas a nuevos ambientes, como durante la plantación de plántulas preinoculadas. Arabidopsis thaliana como fueron elegidos como modelo de planta debido a su amplio uso en estudios de laboratorio, así como a los amplios datos disponibles sobre sus interacciones microbianas^11. Hay tres etapas en el sistema: 1) A. crecimiento thaliana, 2) colonización bacteriana, y 3) mantenimiento bacteriano (ver Figura 1). Debido a que A. thaliana es una planta terrestre, era importante asegurarse de que no estaba sufriendo estrés hídrico indebido en el sistema hidropónico^12. Inspirados en los métodos utilizados por Haney et al.¹³, las plántulas se cultivan en malla de plástico para separar el brote del medio de crecimiento líquido. Este sistema no parece comprometer la salud y el desarrollo del huésped de la planta, y mejora el crecimiento de A. thaliana en líquido^11. A medida que el brote de la planta flota sobre la superficie, las raíces están completamente expuestas a la colonización por bacterias inoculadas en el medio de crecimiento bacteriano líquido. Esto permite que las bacterias de interés sean examinadas para la colonización de nutrientes que son más propicios para el crecimiento, mientras que luego cambia las condiciones para permitir que la planta continúe creciendo en un medio nutritivo diseñado para apoyar su crecimiento. Ambas etapas incluyen temblores constantes para prevenir la anoxia de la raíz¹³. Las bacterias se pueden visualizar o cuantificar desde las raíces de la planta después de la transferencia desde el medio de colonización o el medio de mantenimiento. Este sistema hidropónico es muy flexible, permitiendo que las condiciones experimentales y las tensiones aplicadas se alteren fácilmente dependiendo de los intereses de los investigadores.

Este método descrito es importante en el contexto del cuerpo más amplio de literatura sobre las interacciones entre la planta y los microbios, ya que proporciona un sistema robusto para estudiar estas interacciones en la superficie de la raíz, al mismo tiempo que es personalizable a las preferencias de crecimiento de diferentes bacterias. Los laboratorios de biología vegetal a menudo realizan experimentos de colonización de microbios vegetales en agar sólido, lo que permite sólo el movimiento plano (si eso) de bacterias, al tiempo que requiere la manipulación potencialmente destructiva de las plantas durante la transferencia posterior. Por el contrario, los laboratorios de microbiología han priorizado con frecuencia la salud de las bacterias dentro de sus experimentos, en detrimento de las plantas^14,15. Estas diferentes prioridades de los laboratorios centrados en plantas y microbiología han hecho históricamente difícil comparar resultados entre estos grupos, ya que cada uno suele optimizar las condiciones experimentales para optimizar su organismo de interés^15. El sistema de crecimiento de plantas de malla flotante descrito aquí previene la inmersión completa de la planta, una ventaja notable para estudios anteriores orientados a la microbiología, al tiempo que optimiza temporalmente el crecimiento y la supervivencia de las bacterias para facilitar la colonización. Por lo tanto, el ensayo que presentamos aquí puede abordar las preocupaciones de ambos biólogos de plantas (sobre la sobrehidratación y la manipulación táctil de la planta) al tiempo que satisface los criterios de los microbiólogos (permitiendo diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y múltiples interacciones de especies)⁷. Este protocolo está diseñado para ser adaptable para su uso con diversas bacterias, plantas y condiciones ambientales.

Protocolo

NOTA: La configuración experimental se describe para mayor claridad y se utiliza para generar los resultados representativos incluidos en este informe, pero las condiciones se pueden modificar según se desee. Todos los pasos deben realizarse utilizando EPI y siguiendo las recomendaciones institucionales y federales para la seguridad, de acuerdo con el estado BSL de las bacterias utilizadas.

1. Caracterización de bacterias

1. Determinar la morfología de las bacterias en la placa de agar medio de crecimiento. Resuspenda las células a una OD aproximada de₆₀₀ o 0,5 y placa un volumen de 1 l en el medio de agar de elección. Añadir X-gal a las placas de agar a una concentración final de 20 mg/ml para diferenciar mejor a los miembros individuales de la comunidad bacteriana específica. Crecer a 24oC o 30oC hasta que se formen colonias, luego toma fotos y notas sobre la morfología de la colonia.
2. Definir la correlación entre la densidad óptica de cada cepa bacteriana y el número de Ufc (unidades formadoras de colonias) por ml^16. Resuspender las bacterias en 1 ml de agua en una placa de 24 pocillos a una OD aproximada_{de 600} x 5, realizar dos diluciones seriales, monitorizar₆₀₀ OD de todas las diluciones y placa cada una para determinar la CFU/ml viable en cada muestra a múltiples densidades ópticas.
3. Determinar la tolerancia máxima de sonicación para cada cepa bacteriana. Para ello, las células alícuotas en una placa de 24 pocillos que contienen medio líquido, reservando algunas células como una muestra de control sin sonicar. Usando un ultrasonicador con un accesorio de cuerno de 24 puntas, aplique tres rondas de 12 s de sonicación a 40 amperios con pulsos de 2 s.
   NOTA: Se recomienda el uso de un ultrasonicador de 24 pozos para facilitar la multiplexación aguas abajo de las muestras de la planta de procesamiento, pero si uno no está disponible, utilice un ultrasonicador equipado con un microtip y realice cada sonicación de muestra de forma independiente. Use siempre orejeras nominales con al menos 25 NRR de protección.
4. Realice diluciones seriales de 10 veces de las muestras sonicadas y sin sonicar y atraviese en placas de agar. Determine si hay una reducción en las células viables después de la sonicación. Si es así, utilice una muestra fresca y repita el paso de sonicación utilizando un tiempo de sonicación total reducido o amplitud hasta que el tratamiento no tenga ningún efecto sobre la UFC/ml¹⁷final.

2. Preparación de plántulas Arabidopsis thaliana sobre una malla de plástico

1. Cree discos de la malla de plástico utilizando un perforador de orificio estándar.
   1. Recoger los discos en un recipiente de vidrio con una cubierta suelta de papel de aluminio, y esterilizar utilizando un autoclave establecido en un ciclo seco de 20 minutos¹³.
   2. Usando pinzas esterilizadas por llama, distribuya aproximadamente 40 discos de malla esterilizada en una sola capa a través de la superficie de una placa de agar medio de crecimiento vegetal. Utilice sales de Murashige y Skoog (MS) de 0,5x, que contengan 500 mg/L de tampón MES [2-(N-morpholino)ácido etanosulfónico] y 1,5% de agar Bacto, como medio de crecimiento vegetal, con 50 g/ml de benomyl añadido al límite de contaminación fúngica de las plántulas.
2. Preparar semillas axenicas de A. thaliana como se describió anteriormente¹⁷.
   1. Coloque aproximadamente entre 100 y 300 semillas cada una en tubos de centrífuga individuales en un estante y colóquelas en un recipiente de vidrio o plástico pesado o resellable ("jar") en una campana de humos.
   2. Con precaución, coloque un vaso de 100 ml de lejía en el frasco, agregue 3 ml de HCl concentrado a la lejía, e inmediatamente sellar el frasco y dejar que los humos esterilizan las semillas durante al menos 4 h.
   3. Retire cuidadosamente los tubos de las semillas esterilizadas de debajo del frasco y selle.
3. Coloque dos semillas en el centro de cada malla. Sellar las placas con cinta quirúrgica e incubar durante 2-6 días a 4 oC en la oscuridad para vernalizar las semillas.
4. Para germinar y cultivar plántulas, coloque el lado del agar de la placa hacia abajo en una cámara de crecimiento de la planta durante 8-10 días en entornos de día corto: 9 h de luz a 21 oC y 15 h de oscuridad a 18 oC (Figura1, paso 2).

3. Colonización de plantas en medio de crecimiento bacteriano líquido

1. Añadir 1 ml de medio de crecimiento bacteriano a cada pocal de una placa estéril de 24 pocillos, excepto para los pozos de control solo multimedia. Utilizar caldo de lennox luria (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl) como medio de crecimiento bacteriano.
2. Transfiera las plántulas germinadas incrustadas en malla de las placas de agar al líquido (Figura1, paso 3a).
   1. Pele suavemente la malla que contiene dos plántulas germinadas hacia arriba y hacia fuera de la placa de agar usando fórceps esterilizados por llama. Elija malla con plántulas de igual tamaño y sin daños.
   2. Si la eliminación del agar no es lisa, deseche esa malla y la planta. Transfiera un flotador a cada pozo de líquido de crecimiento bacteriano, lado de la raíz hacia abajo.
3. Inocular bacterias en pozos que contienen plántulas flotantes.
   1. Resuspender las bacterias cultivadas durante la noche en placas de agar a una OD₆₀₀ equivalente a 10⁸ CFU/ml en el líquido medio de crecimiento bacteriano. Añadir 10 l de suspensión bacteriana a cada pocal para una concentración final de 10⁶ bacterias cFU por poca.
   2. Si prepara una mezcla de bacterias, resuspenda cada una a la OD₆₀₀ equivalente a 10⁸ CFU/ml, mezcle en proporciones iguales y agregue 10 ml de la mezcla final por pozo de líquido.
4. Selle la placa para un crecimiento estéril. Sin tocar el lado pegajoso, presione cuidadosamente la película permeable al gas a través de la placa. Asegúrese de que cada pozo ha sido sellado individualmente mediante la aplicación de presión alrededor de cada uno de los anillos hechos por los pozos. Vuelva a colocar la tapa de plástico de la placa acurrucada sobre la placa y la película permeable al gas (Figura1, paso 3b).
5. Incubar las placas durante 18 h en una cámara de crecimiento vegetal, en las mismas condiciones en que las plántulas fueron germinadas originalmente, excepto en un agitador de placa orbital ajustado a 220 rpm.

4. Mantenimiento de la colonización bacteriana

1. Para enjuagar todos los flotadores (plantas en malla), agregue 1 ml de agua estéril a los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos. Retire la película permeable al gas. Usando fórceps estériles, transfiera flotadores a pozos con agua (Figura1, paso 4a). Enjuagar descansando durante 10 min a temperatura ambiente (RT) sin agitación.
   NOTA: Para determinar la eficiencia de colonización bacteriana de las raíces en lugar de su capacidad para mantener la colonización con el tiempo, las plantas se pueden sacrificar en este paso llevándolas directamente al paso 5.1.
2. Llenar los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos con 1 ml de medio de crecimiento vegetal. Transfiera una malla a cada poca. Cubra con un sello permeable al gas e incubar durante 72 h en el agitador de placaorbital a 220 rpm en la cámara de crecimiento de la planta (Figura1, paso 4b).
3. Repita el ensaquejo tal como se realiza en el paso 4.1 con flotadores después del período de incubación de 72 h.

5. Recolección de bacterias para recuentos celulares viables

NOTA: El número de bacterias por raíz de plántula se puede determinar en cualquier punto de tiempo de incubación. La colonización se puede controlar entre 0 h y 18 h, mientras que el mantenimiento se puede supervisar a partir de las 18 h. Las plantas destinadas a la toma de imágenes pueden pasar directamente a la sección 6.

1. Retire las plántulas de la malla (Figura1, paso 5). Coloque suavemente fórceps esterilizados por llama debajo de las hojas (pero en el lado de la hoja de la malla), y pellizque ligeramente el tallo. Mueve las plántulas hacia arriba y lejos de la malla para desalojar la raíz sin romperla. Si la raíz se rompe, raspe suavemente la parte inferior de malla para recoger toda la longitud.
2. Eliminar las bacterias de las raíces de las plantas. Transfiera las bacterias a los pozos de una placa de 24 pocillos que contiene 1 ml de ddH₂0. Sonicar las muestras como se describe en el paso 1.3.
   NOTA: Con un microscopio, busque las bacterias restantes en la superficie de la raíz en una muestra sonicada. Si las bacterias permanecen, aumente el tiempo total de sonicación o intensidad hasta que no queden bacterias unidas, hasta el nivel más alto de sonicación que no afecte el recuento celular viable según lo determinado en la sección 1.
3. Cuantificar las bacterias en las raíces.
   1. Realizar diluciones seriales de 10 veces de las muestras sonicadas hasta una dilución de 10^-6 en medio de crecimiento bacteriano. Añadir 50 l de cada dilución a placas de agar individuales y esparcir con cuentas de vidrio estériles (o esparcidor bacteriano). Incubar placas a la temperatura óptima para las bacterias hasta que las colonias individuales sean contables.
   2. Una vez distinguible, contar el número de morfología de cada colonia (según se determina en la sección 1), y calcular la CFU de cada especie bacteriana por plántula. Deseche las muestras que muestren contaminación, ya que la contaminación durante la colonización o el mantenimiento puede afectar la presencia bacteriana.

6. Colección de raíces vegetales intactas para microscopía

1. Con fórceps, retire las plántulas de la malla como en la sección 5.
2. Transfiera cada planta a portaobjetos de microscopio.
   1. Coloque la punta de la raíz en la diapositiva y arrastre lejos de la punta para establecer el tiro al ras con la diapositiva, asegurando una raíz enderezada para la mejor imagen. Agregue una gota de agua o un medio de crecimiento de la planta estéril a las muestras para hidratar las interfaces entre los cubreobjetos y los portaobjetos.
   2. Coloque un cubrecristales justo encima de la corona de la raíz (región en caja superior en la Figura1) y debajo de las hojas de brote para evitar la colocación del cubreobjetos (para permitir la imagen de la corona de raíz), y presione suavemente¹⁷.
3. Si utiliza bacterias fluorescentes, imagen utilizando filtros de excitación/emisión apropiados para diferenciar las bacterias entre sí y la raíz de la planta¹⁸.

Resultados

El bien caracterizado PGPB P. simiae WCS417r es conocido por colonizar las raíces de A. thaliana en el cultivo hidropónico. Esta bacteria naturalmente fluorescente se puede visualizar fácilmente mediante microscopía en las raíces de las plántulas después de la colonización (Figura2). Aunque es posible imaginar toda la longitud de estas semilleras A. thaliana' (4-6 mm de longitud) raíces, hacerlo para muchas plantas tomaría...

Discusión

Las plantas en todos los ambientes interactúan con miles a millones de diferentes bacterias y hongos^5,7. Estas interacciones pueden afectar negativa y positivamente a la salud de las plantas, con efectos potenciales sobre el rendimiento de los cultivos y la producción de alimentos. Los trabajos recientes también sugieren que la colonización variable de cultivos por PGPB puede explicar el tamaño impredecible de la planta y el rendimiento de los cultivos en lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017