Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

Résumé

Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.

Résumé

Les bactéries forment des microbiomes rhizosphèrecomplexes façonnés par des microbes en interaction, des organismes plus gros et l'environnement abiotique. Dans des conditions de laboratoire, la colonisation de la rhizosphère par des bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB) peut augmenter la santé ou le développement de plantes hôtes par rapport aux plantes non colonisées. Cependant, dans les milieux de terrain, les traitements bactériens avec PGPB souvent ne fournissent pas d'avantages substantiels aux cultures. Une explication est que cela peut être dû à la perte de la PGPB lors d'interactions avec les microbes du sol endogène au cours de la durée de vie de la plante. Cette possibilité a été difficile à confirmer, puisque la plupart des études se concentrent sur la colonisation initiale plutôt que sur le maintien du PGPB dans les communautés de rhizosphère. On suppose ici que l'assemblage, la coexistence et le maintien des communautés bactériennes sont façonnés par les caractéristiques déterministes du microenvironnement de la rhizosphère, et que ces interactions peuvent avoir un impact sur la survie du PGPB dans les milieux indigènes. Pour étudier ces comportements, un analyse hydroponique de croissance des plantes est optimisée en utilisant Arabidopsis thaliana pour quantifier et visualiser la distribution spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après le transfert vers une croissance différente Environnements. La reproductibilité et l'utilité de ce système sont ensuite validées avec le PGPB Pseudomonas simiaebien étudié. Étudier comment la présence de plusieurs espèces bactériennes peut affecter la dynamique de colonisation et d'entretien sur la racine de la plante, une communauté modèle de trois souches bactériennes (un Arthrobacter, Curtobacterium, et Microbacterium espèces) à l'origine isolée de la rhizosphère A. thaliana est construite. Il est démontré que la présence de ces diverses espèces bactériennes peut être mesurée à l'aide de cet analyse hydroponique de la mainntuence des plantes, qui offre une alternative aux études communautaires bactériennes basées sur le séquençage. De futures études utilisant ce système pourraient améliorer la compréhension du comportement bactérien dans les microbiomes végétaux multispécifiques au fil du temps et dans les conditions environnementales changeantes.

Introduction

La destruction des cultures par les maladies bactériennes et fongiques entraîne une baisse de la production alimentaire et peut gravement perturber la stabilité mondiale¹. Sur la base de la découverte que les microbes dans les sols suppressifs sont responsables de l'augmentation de la santé des plantes², les scientifiques ont demandé si le microbiome végétal peut être exploité pour soutenir la croissance des plantes en modifiant la présence et l'abondance de particulier espèces bactériennes³. Les bactéries qui aident à la croissance ou au développement des plantes sont collectivement appelées bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB). Plus récemment, des études sont passées de la simple identification du PGPB potentiel à la compréhension de la façon dont les interactions inter-royaumes dans le sol, autour des racines ou dans la rhizosphère (la zone qui entoure directement et y compris la surface racinaire) peuvent avoir un impact sur le PGPB. activité⁴.

La colonisation de la rhizosphère par pgPB peut augmenter la santé ou le développement des plantes hôtes en réponse à divers facteurs de stress par rapport aux plantes non colonisées⁵. Cependant, les résultats sont souvent plus variables dans les conditions du sol indigène par rapport à ceux observés dans les serres et laboratoires étroitement contrôlés⁶. Une hypothèse pour cette différence est que la croissance ou le comportement de PGPB peut être inhibé par les bactéries indigènes du sol ou des champignons dans les champs^7,8. Les effets bénéfiques des bactéries de la rhizosphère dépendent généralement de la capacité des bactéries à localiser et à se déplacer vers la racine, 2) coloniser la racine par la formation de biofilms, et 3) interagir avec la plante hôte ou des agents pathogènes par la production de petites molécules métabolites^7,9. N'importe lequel de ces comportements de colonisation peut être affecté par la présence et l'activité des microbes voisins¹⁰.

Nous avons conçu un système pour quantifier et visualiser ces stades distincts de colonisation bactérienne de la rhizosphère (Figure 1). Cette approche facilitera les études sur les raisons pour lesquelles l'entretien à long terme du PGPB n'est pas parfois observé après le transfert des plantes dans de nouveaux environnements, comme lors de la plantation de semis pré-inoculés. Arabidopsis thaliana comme ont été choisis comme un modèle végétal en raison de son utilisation intensive dans les études de laboratoire ainsi que les nombreuses données disponibles sur ses interactions microbiennes¹¹. Il y a trois étapes dans le système : 1) a. thaliana croissance, 2) la colonisation bactérienne, et 3) l'entretien bactérien (voir la figure 1). Parce que A. thaliana est une plante terrestre, il était important de s'assurer qu'il ne souffrait pas de stress hydrique indu dans le système hydroponique¹². Inspirés par les méthodes utilisées par Haney et coll.¹³, les semis sont cultivés sur des mailles en plastique pour séparer la pousse du milieu de croissance liquide. Ce système ne semble pas compromettre la santé et le développement de l'hôte de la plante, et il améliore la croissance de A. thaliana dans le liquide¹¹. Lorsque la pousse de la plante flotte au-dessus de la surface, les racines sont pleinement exposées à la colonisation par des bactéries inoculées dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Cela permet d'examiner les bactéries d'intérêt pour la colonisation des nutriments qui sont les plus propices à la croissance, tout en changeant les conditions pour permettre à la plante de continuer à croître dans un milieu nutritif conçu pour soutenir sa croissance. Les deux étapes comprennent des secousses régulières pour prévenir l'anoxie de la racine¹³. Les bactéries peuvent être visualisées ou quantifiées à partir des racines des plantes après le transfert du milieu de colonisation ou du milieu d'entretien. Ce système hydroponique est très flexible, permettant aux conditions expérimentales et aux contraintes appliquées d'être facilement modifiées en fonction des intérêts des chercheurs.

Cette méthode décrite est importante dans le contexte de l'ensemble de la littérature sur les interactions plantes-microbe, car elle fournit un système robuste pour étudier ces interactions à la surface des racines tout en étant personnalisable aux préférences de croissance de bactéries différentes. Les laboratoires de biologie végétale effectuent souvent des expériences de colonisation des microbes végétaux sur l'agar solide, ne permettant que le mouvement planaire (si cela) des bactéries tout en exigeant la manipulation potentiellement destructrice des plantes lors du transfert ultérieur. En revanche, les laboratoires de microbiologie ont souvent donné la priorité à la santé des bactéries dans leurs expériences, au détriment des plantes^14,15. Ces différentes priorités des laboratoires axés sur les plantes et la microbiologie ont historiquement rendu difficile la comparaison des résultats entre ces groupes, puisque chacun optimise généralement les conditions expérimentales pour optimiser leur organisme d'intérêt¹⁵. Le système flottant-mesh-plant-croissance décrit ici empêche la submersion complète de plante, un avantage notable aux études microbiologiques précédentes, tout en optimisant temporairement la croissance et la survie des bactéries pour faciliter la colonisation. Ainsi, l'analyse que nous présentons ici peut répondre aux préoccupations des biologistes des plantes (sur la surhydratation et la manipulation tactile de la plante) tout en répondant aux critères des microbiologistes (permettant différentes conditions de croissance bactérienne et de multiples interactions des espèces)⁷. Ce protocole est conçu pour être adaptable pour une utilisation avec diverses bactéries, plantes et conditions environnementales.

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Protocole

REMARQUE : La configuration expérimentale est décrite pour plus de clarté et utilisée pour générer les résultats représentatifs inclus dans ce rapport, mais les conditions peuvent être modifiées comme vous le souhaitez. Toutes les étapes doivent être effectuées à l'aide de l'EPI et en suivant les reccomendations institutionnelles et fédérales pour la sécurité, selon le statut BSL des bactéries utilisées.

1. Caractérisation des bactéries

1. Déterminer la morphologie des bactéries sur la plaque d'agar moyenne de croissance. Resuspendre les cellules à un OD approximatif_{de 600} à 0,5 et plaquer un volume de 1 L sur le milieu d'agar de choix. Ajouter X-gal aux plaques d'agar à une concentration finale de 20 mg/mL pour mieux différencier les membres individuels de la communauté bactérienne spécifique. Cultivez à 24 oC ou 30 oC jusqu'à ce que des colonies se forment, puis prenez des photos et des notes sur la morphologie des colonies.
2. Définir la corrélation entre la densité optique de chaque souche bactérienne et le nombre d'unités de formation de CFU (colonies) par mL¹⁶. Resuspendre les bactéries dans 1 ml d'eau dans une plaque de 24 puits à un OD approximatif_{de 600} à 5, effectuer des dilutions en série à deux volets, surveiller OD₆₀₀ de toutes les dilutions, et la plaque chacune pour déterminer le CFU/mL viable dans chaque échantillon à de multiples densités optiques.
3. Déterminer la tolérance maximale à la sonication pour chaque souche bactérienne. Pour ce faire, les cellules aliquot dans une plaque de 24 puits contenant milieu liquide, réservant certaines cellules comme un échantillon de contrôle non soniqueux. À l'aide d'un ultrasonateur avec une fixation de corne à 24 pointes, appliquer trois tours de 12 s de sonication à 40 ampères avec 2 impulsions.
   REMARQUE : Il est conseillé d'utiliser un ultrasonateur de 24 puits pour faciliter le multiplexage en aval des échantillons d'usines de traitement, mais si l'un d'eux n'est pas disponible, utilisez un ultrasonateur équipé d'un micropointe et effectuez chaque sonication d'échantillon indépendamment. Portez toujours des cache-oreilles évalués à au moins 25 protections NRR.
4. Effectuez des dilutions sérielles 10 fois des échantillons sonicated et non sonicated et tachez sur des plaques d'agar. Déterminer s'il y a une réduction des cellules viables après la sonication. Si c'est le cas, utilisez un échantillon frais et répétez l'étape de sonication en utilisant un temps de sonication total réduit ou une amplitude jusqu'à ce que le traitement n'ait aucun effet sur cFU/mL^{final 17}.

2. Préparation des semis Arabidopsis thaliana sur un maillage en plastique

1. Créez des disques de maille en plastique à l'aide d'un poinçonneur de trou standard.
   1. Recueillir les disques dans un récipient en verre avec un couvercle lâche de papier d'aluminium, et stériliser à l'aide d'un autoclave réglé à un cycle sec de 20 min¹³.
   2. À l'aide d'une pince à épiler stérilisée à la flamme, distribuez environ 40 disques de maille stérilisés en une seule couche sur la surface d'une plaque d'agar à croissance végétale moyenne. Utilisez 0,5x sels de Murashige et de Skoog (MS), contenant 500 mg/L de tampon MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acide] et 1,5% Bacto agar, comme milieu de croissance des plantes, avec 50 g/mL de bénomyl ajouté à la contamination fongique limite des semis.
2. Préparer les graines hacheniques de A. thaliana comme décrit précédemment¹⁷.
   1. Placer environ 100 à 300 graines chacune dans des tubes de centrifugeuse individuels dans une grille et placer dans un récipient en verre refermable ou en plastique lourd (« pot ») dans un capuchon de fumée.
   2. Par prudence, placer un bécher de 100 ml d'eau de Javel dans le bocal, ajouter 3 ml de HCl concentré à l'eau de Javel, et sceller immédiatement le pot et laisser les vapeurs stériliser les graines pendant au moins 4 h.
   3. Retirez soigneusement les tubes de graines stérilisées sous le bocal et scellez.
3. Placer deux graines au centre de chaque maillage. Scellez les plaques avec du ruban adhésif chirurgical et incuber pendant 2 à 6 jours à 4 oC dans l'obscurité pour vernaliser les graines.
4. Pour germer et cultiver les semis, placez le côté agar de plaque vers le bas dans une chambre de croissance de plante pendant 8-10 jours dans des arrangements courts de jour : 9 h de lumière à 21 oC et 15 h d'obscurité à 18 oC (figure1, étape 2).

3. Colonisation des plantes dans le milieu de croissance bactérienne liquide

1. Ajouter 1 ml de milieu de croissance bactérienne à chaque puits d'une plaque stérile de 24 puits, à l'exception des puits témoins à faible intensité de médias seulement. Utilisez Lennox Luria Broth (10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl) comme milieu de croissance bactérienne.
2. Transférer les semis germés enmaillés dans le maillage des plaques d'agar au liquide (figure1, étape 3a).
   1. Épluchez délicatement la maille contenant deux semis germés vers le haut et hors de la plaque d'agar à l'aide de forceps stérilisés par flamme. Choisissez un maillage avec des semis de taille égale et intact.
   2. Si l'enlèvement de l'agar n'est pas lisse, jetez ce maillage et plantez. Transférer un flotteur dans chaque puits de liquide de croissance bactérienne, côté racine vers le bas.
3. Inoculer les bactéries dans les puits contenant des semis flottants.
   1. Resuspendre les bactéries cultivées du jour au lendemain sur des plaques d'agar à un OD₆₀₀ équivalent à 10⁸ CFU/mL dans le liquide moyen de croissance bactérienne. Ajouter 10 ll de suspension bactérienne à chaque puits pour une concentration finale de 10⁶ bactéries CFU par puits.
   2. Si vous préparez un mélange de bactéries, suspendez-les chacune à l'OD₆₀₀ équivalant à 10⁸ CFU/mL, mélangez dans des proportions égales, et ajoutez 10 L du mélange final par puits de liquide.
4. Sceller la plaque pour une croissance stérile. Sans toucher le côté collant, appuyez soigneusement sur le film perméable au gaz sur la plaque. Assurez-vous que chaque puits a été scellé individuellement en appliquant une pression autour de chacun des anneaux fabriqués par les puits. Remplacer le couvercle en plastique de la plaque confortablement sur la plaque et le film perméable au gaz (Figure 1, étape 3b).
5. Incuber les plaques pendant 18 h dans une chambre de croissance des plantes, dans les mêmes conditions que les semis ont été germés à l'origine, sauf sur un shaker de plaque orbitale réglé à 220 tr/min.

4. Maintien de la colonisation bactérienne

1. Pour rincer tous les flotteurs (plantes sur maille), ajouter 1 ml d'eau stérile aux puits d'une nouvelle plaque de 24 puits. Enlever le film perméable au gaz. À l'aide de forceps stériles, transférer les flotteurs vers les puits avec de l'eau (figure1, étape 4a). Rincer en vous reposant 10 min à température ambiante (RT) sans agitation.
   REMARQUE : Pour déterminer l'efficacité bactérienne de colonisation des racines plutôt que leur capacité à maintenir la colonisation au fil du temps, les plantes peuvent être sacrifiées à cette étape en les prenant directement à l'étape 5.1.
2. Remplir les puits d'une nouvelle plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu de croissance des plantes. Transférer un maillage à chaque puits. Couvrir d'un joint perméable au gaz et couver pendant 72 h sur le shaker de plaque orbitale à 220 tr/min dans la chambre de croissance des plantes (figure1, étape 4b).
3. Répétez le rinçant tel qu'il est effectué à l'étape 4.1 avec des flotteurs après la période d'incubation de 72 h.

5. Collecte de bactéries pour des comptes cellulaires viables

REMARQUE : Le nombre de bactéries par racine de semis peut être déterminé à n'importe quel point d'incubation. La colonisation peut être surveillée entre 0 h et 18 h, tandis que l'entretien peut être surveillé à partir de 18 h. Les plantes destinées à l'imagerie peuvent passer directement à l'article 6.

1. Retirez les semis du maillage (Figure 1, étape 5). Placez délicatement les pincements à flammes sous les feuilles (mais sur le côté de la feuille de la maille) et pincez légèrement la tige. Remuer les semis vers le haut et loin de la maille pour déloger la racine sans la casser. Si la racine se brise, gratter doucement le fond de maille pour recueillir toute la longueur.
2. Enlever les bactéries des racines des plantes. Transférer les bactéries dans les puits d'une plaque de 24 puits contenant 1 ml de ddH₂0. Sonicate les échantillons tels que décrits à l'étape 1.3.
   REMARQUE : À l'aide d'un microscope, recherchez les bactéries restantes sur la surface de la racine sur un échantillon sonicated. Si les bactéries demeurent, augmentez le temps de sonication total ou l'intensité jusqu'à ce qu'aucune bactérie ne reste liée, jusqu'au niveau le plus élevé de sonication qui n'affecte pas le nombre de cellules viables tel que déterminé à la section 1.
3. Quantifier les bactéries sur les racines.
   1. Effectuez des dilutions sérielles de 10 fois des échantillons sonicated jusqu'à une dilution de 10-6 dans le milieu de croissance bactérienne. Ajouter 50 l de chaque dilution dans des plaques d'agar individuelles et les étaler avec des perles de verre stériles (ou un épandeur bactérien). Incuber les plaques à la température optimale pour les bactéries jusqu'à ce que les colonies individuelles soient comptées.
   2. Une fois distinguable, compter le nombre de chaque morphologie de chaque colonie (tel que déterminé à la section 1) et calculer l'UFC de chaque espèce bactérienne par semis. Jetez tous les échantillons montrant une contamination, car la contamination pendant la colonisation ou l'entretien peut affecter la présence bactérienne.

6. Collection de racines végétales intactes pour la microscopie

1. À l'aide de forceps, retirer les semis du maillage comme à l'article 5.
2. Transférer chaque plante sur des lames de microscope.
   1. Placez la pointe de la racine sur la glissière et éloignez-vous de la pointe pour régler la pousse avec la glissière, assurant ainsi une racine redressée pour une meilleure imagerie. Ajouter une goutte d'eau ou un milieu de croissance des plantes stériles aux échantillons pour hydrater les interfaces entre les couvertures et les lames.
   2. Placez un bordereau en verre juste au-dessus de la couronne racine (région la plus en boîte supérieure dans la figure 1) et au-dessous des feuilles de pousse pour éviter l'inclinaison de la couverture (pour permettre l'imagerie de la couronne racine), et appuyez doucement vers le bas¹⁷.
3. Si vous utilisez des bactéries fluorescentes, imagez à l'aide de filtres d'excitation/émission appropriés pour différencier les bactéries les unes des autres et de la racine végétale¹⁸.

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Résultats

Le PGPB P. simiae WCS417r bien caractérisé est connu pour coloniser les racines de A. thaliana dans la culture hydroponique. Cette bactérie naturellement fluorescente peut facilement être visualisée à l'aide de microscopie sur les racines des semis après la colonisation (figure 2). Bien qu'il soit possible d'imaginer toute la longueur de ces racines de semis A. thaliana (4 à 6 mm de longueur), cela prendrait un temps prohibi...

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Discussion

Les plantes dans tous les environnements interagissent avec des milliers à des millions de bactéries et de champignons différents^5,7. Ces interactions peuvent avoir un impact négatif et positif sur la santé des plantes, avec des effets potentiels sur le rendement des cultures et la production alimentaire. Des travaux récents suggèrent également que la colonisation variable des cultures par les PGPB peut expliquer la taille imprévisible des plantes et le ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017